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（1）“挑”——差异分析

接下来，直接步入正题，直接探讨肿瘤样本和正常样本中的突变差异。所有样本中显示了4275个体细胞外显子突变，包括3717个错义， 327个无义， 1607个沉默， 75个剪接位点， 95个移码插入和缺失(indel)和61个框内indel 。在PSCC样本中发现的全套核苷酸变异体在S2补充表中有描述。在PSCC发现的30种最常见的外显子突变在图1A的癌胚抗原表中有描述。患者的肿瘤突变负荷(TMB)是通过将单核苷酸变异体的总数(SNV)除以WEX测序覆盖的基因组数量(~64兆碱基)来确定的。两个病人(14T和27T)被归类为超突变型(图1B) 。突变间距离的分析通过仅在这两个样品中鉴定超突变基因座的区域(平均距离小于或等于1000个碱基对的6个连续突变)进一步证实了这种分类(图1C) 。

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(图1A-C)

（2）“圈”——富集分析

在通路相关的分析中， Notch途径在PSCC样本中受影响最频繁，其中70.6%的样本(n=24)在17个缺口基因中的至少一个基因中有突变，包括Notch 1 (n=15 ， 44.1%)、EP300 (n=5 ， 14.7%)和FBXW7 (n=5 ， 14.7%)(图1D) 。

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(图1D)

其他高度受影响的途径是:20例(58.8%)患者中有17个突变基因的Hippo 途径，其中12例(35.3%)出现FAT1突变；16例患者中有22个突变基因，占47.1% ，其中HRAS突变3例(8.8%) ， NF1突变3例；15例患者中仅有3个突变基因的p53通路(44.1%) ，但其中12例(35.3%)有TP53突变；PI3K、细胞周期和Wnt途径在11例(32.3%)患者中发生突变， PIK3CA、CDKN2A (n=10 ， 29.4%)和CHD8 (n=3 ， 8.8%)突变分别是每种途径中最常见的。 Nrf2 (n=4 ， 11.7%)、TGF-β (n=3 ， 8.8%)和MYC (n=3 ， 8.8%)在PSCC样本中的富集度较低，在2个以上的样本中没有基因突变。

接下来作者将突变进行富集分析，发现PIK3CA和CDKN2A的突变在特定的蛋白位点显著富集，表明这些可能是PSCC的潜在驱动突变(图S2) 。 PIK3CA突变p.E545K/G、E542K和E453K都被OncoKB认为是功能增益致癌突变，而CDKN2A突变p.R80X、p.E88X、p . G65fs、p.D108G和p.R115fs被归类为潜在的功能丧失和致癌因素。

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(图S2)

作者根据5’端和3’端碱基的单碱基替换频率，对每个患者的突变模式进行了评估，对96种不同的突变类型进行了分类。通过执行共基因分析，在PSCC样本中确定了两种不同的突变模式，作者称之为突变模式1 (MP1)和2 (MP2)(图2A和2B) 。图2C描述了每个样品中这两种突变模式的每一种的富集。 MP1在9个PSCC样本中最普遍，而MP2在其他25个病例中更普遍。然后将这些突变模式与来自宇宙数据库的已知癌症突变特征进行比较。然后，作者在COSMIC数据库中进行验证，找到这些特征之间最接近的匹配(图2D) 。

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(图2A-D)

3
“联”——联系临床病理

上述突变分析已经做完了，并找到了潜在的通路，下一步作者就是要分析“病因”——HPV病毒。作者接下来对每例样本都进行了个性化的分析，通过分析从上述突变分析及富集的潜在通路的结果相对比，以找到患病的确切病因。

p16免疫高表达是临床认可的宫颈和口咽部肿瘤HPV感染的替代标志物。虽然在大多数PSCC病例中HPV检测和p16染色相关，但是在2个样品(17T和2T)中通过HPV聚合酶链反应检测到HPV ，但是IHC检测为p16阴性。对于这样的情况，作者分析认为是检测到无意义CDKN2A突变，这可以解释p16免疫表达的缺失。

然而，病例17T显示了TP53和CASP8突变，这在TCGA数据库的HPV阳性肿瘤中是罕见的。这两个病例是否是由于HPV引起的尚不清楚。 HPV检测与ARPP21、CMYA5和RPGRIP1基因突变显著相关(所有突变患者均为HPV+ ， p = 0.004 ， p = 0.020 ， p = 0.020) 。 P53途径基因(TP53和CHECK2)仅在2例(20%) HPV阳性病例中发生突变，而一半以上(n=13 ， 54.2%)HPV阴性病例在其中一个基因中发生突变(p=0.128) 。在HPV阳性的PSCC人群中，无Nrf2途径基因突变。 p16免疫表达与CSPG4和TP53显著相关。 P53通路基因影响14例p16阴性肿瘤(53.8%) ，但只有1例(12.5%) p16阳性(p=0.053) 。 p16阳性肿瘤中未检测到Nrf2途径突变。 20% (n=3)的p53通路突变患者出现局部复发，而在没有p53通路突变的患者中未检测到LR 。事实上，所有局部复发病例都发生在TP53突变患者中。虽然局部复发的发生率很低(n=3) ，但这些患者中有2例(66.7%)为TGF-β途径突变，且均有Notch途径突变。

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