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加州大学伯克利《Chem. Sci》活细胞中钾离子比例荧光成像的双荧光传感器( 二 )


示意图2PS525的合成 。
作者评估了PS525在缓冲至生理pH（50 mM HEPES ， pH 7.4）的水溶液中的光学性质 。 PS525显示了在525 nm处的最大吸收峰 ， 在存在K+的情况下 ， 在0和200 mM的K+下 ， 计算出的吸收系数分别为ε= 61 100 M-1 cm-1和ε= 65 000 M-1 cm-1（图5） 。 当暴露于K+时 ， PS525的荧光发射集中在552 nm处开启7倍（图2b） ， 量子产率从不存在K+时的0.03增加到存在K+时的0.15（图2b） 。 根据Benesi–Hildebrand图K+滴定反应 ， 探针的Kd值计算为137 mM ， 与150 mM范围内的细胞内[K+
匹配 。
接下来 ， 作者与一组生物学相关的碱金属 ， 碱土金属和过渡金属相比 ， 测试了PS525对K+的金属选择性（图2c） 。 值得注意的是 ， 即使对K+的亲和力很低 ， PS525在相关的细胞内水平上对Na+的选择性也比对Na+高出五倍 ， 这预示它对下游生物学应用具有足够的敏感性和选择性 。 然后 ， 作者测试了PS525和香豆素343对细胞内K +浓度（140 mM）附近K+的比率响应的敏感性（图2d） 。 在80 mM至120 mM的范围内 ， 进行线性回归分析以计算5.8 mM的检出限 。 另外 ， PS525和香豆素343的pH敏感性测试证明了它们在生理pH下的可用性 。
3.由PS525和香豆素343染料合成钾比例传感器1（RPS-1）的方法以及活细胞中K+水平的比例荧光成像
在确定PS525是选择性和敏感的荧光K+敏感染料单元后 ， 作者将2-(3H-[123
triazolo[45-b
pyridine-3-yl)-1133-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TATU) 作为碳酸盐激活剂 ， 通过将PS525与先前报道的香豆素synthon63酯化来合成RPS-1 。 作者测试了RPS-1的荧光响应和酯酶催化的水解 。 然后 ， 将RPS-1用于通过共聚焦显微镜对细胞内K+池进行比例荧光成像 ， 并考虑到PS525传感单元能够选择性地对体外水性缓冲液中生物学相关浓度的K+水平做出反应 。 注意到 ， 对K+不敏感的香豆素343的量子产率为0.02 ， 与PS525部分相当 ， 但在单独的458 nm波长处被激发 。 在成像之前 ， 首先将HeLa细胞与10μMRPS-1孵育 ， 以确保探针摄取和酯酶裂解 。 使用Coumarin 343单元的458 nm激发（蓝色通道）和PS525单元的514 nm（绿色通道）激发 ， 获得了双色共焦显微镜图像 。 然后使用这两个通道（绿色通道/蓝色通道 ， 图3b）获得比率图像 。 为了评估RPS-1是否可以通过其PS525单元响应细胞内K+的变化 ， 然后用5μM缬霉素对HeLa细胞进行处理 ， 这种化合物已知可以通过膜螯合和转运钾 ， 并耗尽K+的细胞内池 。 在添加缬氨霉素后的0、5、15、30、45、60分钟拍摄了来自两个通道的共焦图像 ， 并与媒介物对照进行了比较 。 与媒介物对照组相比 ， 作者观察到了由缬氨霉素刺激的HeLa细胞中绿色/蓝色比率强度的明显降低（图3c） 。
图3（a）RPS-1的合成和使用RPS-1的细胞内K+库的比例成像 。 （b）使用RPS-1的基于时间的比例荧光成像可以监测用5μM缬氨霉素处理1 h的活HeLa细胞中细胞内K+库的消耗 。 绿色通道显示在514 nm激发下来自PS525发色团的发射 ， 蓝色通道显示在458 nm激发下来自香豆素 343发色团的发射 。 来自两个通道的荧光比图像由ImageJ构建 。 （c）通过ImageJ测量和分析绘制的多个生物学重复样本的平均荧光强度比 。
参考文献：
doi.org/10.1039/D0SC03844J
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