抗体 免疫电镜技术简介及样本准备注意事项


抗体 免疫电镜技术简介及样本准备注意事项
文章图片

免疫电镜技术也称免疫细胞化学技术 , 是由免疫化学技术与电镜技术相结合的一种实验技术手段 , 是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学 。 抗原、抗体的相互作用是免疫化学反应的基础 , 它具有高度的特异性 , 结合电镜的高分辨和放大特点 , 可以在超微结构和分子水平上研究各种组织和细胞内的免疫反应 , 并能精确定性、定位和半定量 , 使形态与机能紧密结合 。
目前免疫电镜主要分为有标记物和无标记物两大类 。 无标记物类的常用方法为免疫凝集电镜技术 , 即采用抗原抗体凝集反应后 , 再经负染色直接在电镜下观察 。 有标记物类 , 最早由Singer在1959年建立的铁蛋白(ferritin)标记抗体技术;后由Nakane和Pierce在1968年建立的酶标记抗体技术;以及由Faulk和Taylor在1971年建立的胶体金标记技术 。
【抗体|免疫电镜技术简介及样本准备注意事项】该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合 , 在电子显微镜下观察 , 由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位 。 免疫电镜的应用 , 使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平 。
免疫电镜样本准备方法及要求:
一、动物组织样本
组织取下后立即投入免疫电镜固定液内室温固定2h , 再转移至4℃保存 , 4℃冰袋运输 。 样品固定后应尽快安排做后续包埋和免疫标记实验 , 减少抗原丢失的可能性 。
1-3min内取样 , 取样组织1mm3大小 。 取材前可提前准备装有免疫电镜固定液的培养皿 , 将小组织块离体取下后立即投入培养皿内 , 用手术刀在培养皿的固定液中进行切割成1mm3的小组织块 。 再将切割好的小组织块转移至装有新的免疫电镜固定液的EP管内继续固定 。
取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤 , 刀片要锋利避免挫伤组织 。
二、细胞样本
1、贴壁细胞:
①培养好的细胞弃培养基 , 加入免疫电镜固定液 。
②常温固定5min左右 , 用细胞刮(或软橡胶盖切得平整小方块)沿一个方向轻轻刮下细胞 , 切记不要反复刮 , 避免细胞刮破 。
③用巴氏吸管把细胞液吸入离心管内 , 放入离心机1000转离心2min左右 , 弃固定液后加新的免疫电镜固定液 , 把细胞团轻轻挑起 , 悬浮于固定液中 。
④室温避光固定30min , 再转移至4℃保存 , 4℃冰袋运输 。
2、悬浮细胞:离心收集细胞要肉眼可见 , 弃培养基后加免疫电镜固定液室温固定2h , 再转移至4℃保存 , 4℃冰袋运输 。
三、细菌样本
收集细菌放于免疫电镜固定液内室温固定2h , 再转移至4℃保存 , 4℃冰袋运输 。
四、病毒
破碎组织细胞 , 粗离心去除细胞碎片取上清 , 超速离心分离出病毒(病毒提取的过程需要客户自己完成) 。 用缓冲液(如PBS)悬浮病毒 , 远距离-80℃冻存运输 , 近距离4℃保存运输 。
五、外泌体囊泡等
客户自己完成外泌体囊泡等的提取收集 , 用缓冲液(如PBS)或者试剂盒中的保存液悬浮 , 远距离-80℃冻存运输 , 近距离4℃保存运输 , 尽快制片做免疫标记后及时电镜观察拍照 。

    推荐阅读