MicroED、X射线衍射与冷冻电镜SPA与X射线晶体学单颗粒法在结构生物学上的应用是如何优势互补的？( 二 ) _x光

冷冻电子显微镜解析的生物大分子三维结构数目的变化趋势

Glucagon-GCGR-GS-Nb35和glucagon-GCGR-Gi1-Scfv16
单颗粒分析技术不需要得到晶体且样品使用量非常少，这使得针对难以结晶的膜蛋白或大分子复合物的研究成为可能。然而，虽然单颗粒分析技术对样品要求量较低，却没有降低对样品均一性的高要求。而且，虽然随着探测器和算法的不断提升，单颗粒分析技术已经能够得到分辨率2 ?以内的结构4 ，但仍然是相对个例，其分辨率普遍还是在3 ?左右。不过，人类之所以能创造文明，就在于对神秘自然、科学真相永无止境的探索；而各研究领域的不断发展推进，势必会相互影响、相互促进。

MicroED——晶体学与冷冻电子显微镜在当代的完美糅合

在电子显微镜发展初期， X射线晶体学技术正蓬勃发展；此时，也正处于衍射理论和数据处理方法逐渐成熟之时。电子晶体学就是电子显微镜技术与晶体学结合的产物。在2007年，斯德哥尔摩大学的科学家聪明地将晶体学和电镜相结合，用冷冻电镜去看晶体，发展出了一项重要的新技术——MicroED (Micro electron diffraction) 。 MicroED主要是通过电子对微小的晶体进行衍射，然后收集电子衍射数据并进行蛋白质结构解析的方法。由于电子的波长短，则受物质散射强（原子对电子的散射能比X射线强一万倍），所以能够达到的分辨率更高。而且其需要的晶体尺寸非常小，亚微米尺寸的晶体就可以产生足够高的信噪比衍射信号。这些独特优势对于那些能够得到微小晶体而尺寸无法优化变大的样品来说，无疑是个好消息。这种技术2018年还被《Science》杂志评为2018年十大技术突破之一。在MicroED发展初期，溶菌酶、catalase和Ca2+-ATPase等模式样品就被解析到原子分辨率。后来MicroED进一步发展，不再局限于模式样品，还解析了α-synuclein中心肽段和R2lox酶6等未知蛋白的结构（见图3），并且分辨率都高达~1 ? 。 2016年后， MicroED发展迅速，解析的蛋白质结构的数量也快速增加（见图4）， prions和FUS LC（fused in sarcoma low-complexity domain）等样品的晶体结构都得到了1 ?左右的高分辨率（见图4）。而后MicroED解析的对象难度逐渐增加，甚至还包括了复合物和离子通道等膜蛋白（见图4）。从2018年开始，人们将MicroED与冷冻聚焦离子束技术（cryo-Focused Ion Beam cryo-FIB）技术相结合，可以将尺寸稍大但仍不适用与X射线晶体学的晶体剪薄，将适用于MicroED的晶体尺寸范围扩大至几十微米，大大拓宽了MicroED技术的应用范围，填补了MicroED和X射线晶体学之间的空隙。

MicroED解析的R2lox结构

MicroED的研究统计流程简、分辨率高、时间短——MicroED打开结构生物学探索的新方式

流程简、分辨率高、时间短——MicroED打开结构生物学探索的新方式

MicroED的原理类似于X射线晶体学。电子波同X射线一样，照射到类似晶体的样品上时也能够发生衍射现象。当中间镜的物平面位于物镜的后焦面时，将在荧光屏上得到经中间镜和投影镜放大了的电子衍射谱，即为透射电子显微镜的衍射模式。在实际的透射电子显微镜中，成像模式和衍射模式的中间镜电流已设置好，通过相应按钮（Diffraction按钮）即可实现两个模式的切换。 MicroED对结构生物学领域起到了很好的补充。
【MicroED、X射线衍射与冷冻电镜SPA与X射线晶体学单颗粒法在结构生物学上的应用是如何优势互补的？】