美国科学院院报：生物源性非晶钙「ACC」——碳酸钙最易溶形式( 三 ) _蛋白质

此外，注射了GAP 65 dsRNA 和蜕皮激素的小龙虾胃石的扫描电子显微镜 (SEM) 图像显示出严重的超微结构异常。
在正常胃石中观察到的致密矿物和层状结构被松散堆积的柱状矿化结构所取代，类似于中空的稻草（图6 A和B）。
在这些密度较小的胃石中，小球的大小在 150 到 200 nm 之间，而在胃石中沉积的正常 ACC 中，小球的范围在 40 到 60 nm 之间（图6C）。
图6

SEM of gastroliths shows structural deformities after GAP 65 silencing. Representative gastroliths dissected from crayfish injected with ecdysone and GAP 65 dsRNA (Left) or the ecdysone and dsRNA vehicles (Right). (A and B) Cross-sections of the central part of the gastrolith demonstrating the mineral and matrix arrangement. (Scale bars: 100 μm in A and 10 μm in B.) (C) Mineral nanospherule arrangement. (Scale bar: 1 μm.)

最后，为了阐明 GAP 65 在生物矿化过程中的作用，建立了一种体外碳酸钙沉淀试验，测试稳定的合成 ACC 的形成。
在作为对照蛋白的胰蛋白酶存在下的沉淀导致出现方解石晶体与典型球晶球霰石聚集体混合的结晶沉淀物，两者的尺寸均约为 10 μm（图7A）。
另一方面，在 GAP 65 存在下的沉淀导致大部分 40-60-nm ACC 球体的沉积，以及一些方解石和球霰石（图 7 B）。 ACC保持稳定并且至少2个月没有结晶。
图7

In vitro precipitation of calcium carbonate in the presence of purified gastrolith proteins. (A) SEM image and Raman spectra of crystalline (calcite and vaterite) calcium carbonate precipitate in the presence of trypsin. (B) SEM image and Raman spectra of ACC precipitate in the presence of GAP 65-enriched fractions. (C) Coomassie-stained SDS/PAGE separation of GAP 65-enriched fractions (I) and protein extract from the synthetic ACC (II). MW molecular mass markers. Arrowhead points to GAP 65.

拉曼分析证实了在 GAP 65 存在下产生的合成 ACC 的稳定性质及其延长的稳定性，如在 1085 cm -1处的明显宽峰所示，而在胰蛋白酶存在下，在 1085 cm -1处有一个尖峰，指示方解石的存在，被检测到。
通过纯化从沉淀的矿物部分中提取的蛋白质，包括主要的 65-kDa 带，类似于在富含 GAP 65 的部分中发现的带，证实了在体外沉淀测定形成的 ACC 中存在封闭的 GAP 65 (图7C ) 。

在本研究中，证明了C. quadricarinatus胃石的富含蛋白质的分布，其中最丰富的蛋白质是 GAP 65 。

与其他生物矿化相关蛋白质的报道 ( 13 – 1520 ) 相比， GAP 65 是不特别富含任何氨基酸，也不包括在其他甲壳类动物钙化或表皮蛋白中发现的任何序列基序。
值得注意的是，在蓝蟹的外骨骼中发现了一种 66 kDa PAS 阳性、EDTA 可溶性蛋白质，刺槐。然而，只有该蛋白质的前 15 个残基是已知的 ( 21 ) 并且与 GAP 65 没有同源性。
引人注目的是， GAP 65、vermiform 和蛇纹石几乎 50% 相同，并且都包含相同的三个 ChtBD2、LDLa 和多糖脱乙酰酶结构域，并且在功能未知的 C 末端区域具有长段。
据我们所知，在甲壳类动物中只有极少数关于这一领域的报道，迄今为止仅在虾卵皮质隐窝中发现。 ChtBD2 结构域主要存在于昆虫的围养基质蛋白和一些几丁质酶中。）。在这一点上，只能推测为什么胃石中最丰富的蛋白质包含如此稀有的结构域。
尽管 GAP 65 确实具有钙结合能力，如在放射性钙结合试验中观察到的（数据未显示），但 GAP 65 的序列缺乏任何已知的钙结合基序。因此，这些钙结合能力可能归因于 LDLa 结构域，据报道它可以与发现它的蛋白质提供钙结合（31）。
事实上， LDLa 结构域在胃石蛋白中的确切作用尚未完全了解。已经声称磷酸化丝氨酸参与钙结合甲壳类动物蛋白，在 CAP-1（钙化相关肽）的情况下，从Procambarus clarkii的外骨骼中分离出来，以及在 orchestin的情况下，并且可能参与GAP 65 也是如此。
此外，尽管其主要功能是将几丁质转化为壳聚糖，但多糖脱乙酰酶结构域在 GAP 65 功能中的作用尚不清楚。
研究 · 结论在胃石形成（蜕皮前）期间，胃石盘上皮和角质层表皮下组织中检测到GAP 65的表达，但在蜕皮期间在胃石盘上皮中未检测到，表明蜕皮激素参与 GAP 65 诱导。然而，表达谱确实与报道的从胃石细胞外基质中分离的唯一其他蛋白质，即 GAMP ，相同蜕皮阶段在两种组织中检测到的表达谱一致。
据报道，来自甲壳类钙化组织的特定蛋白质或蛋白质提取物可作为体外碳酸钙沉淀抑制剂或作为结晶调节剂。有人提出 CAP-1 可能参与小龙虾外骨骼的 ACC 稳定化；但是，没有提供任何证据。