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当前 ， COVID-19 在世界范围内大流行 ， 已造成超过两亿人次的感染和四百多万人次的累计死亡 ， 基于 qRT-PCR（定量逆转录酶-聚合酶链反应）的检测是当前诊断 COVID-19 的金标准 。 尽管说这种方法具有很高的敏感性 ， 但其操作仍然过于复杂 ， 检测时间长达数小时 ， 无法实现快速的即时检测 。 因此 ， 开发比 qRT-PCR 更快速、更容易实施的诊断检测策略显得尤为重要 。
CRISPR/Cas 系统是用于基因编辑的分子生物学工具 ， 有准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力 。 2020 年的诺贝尔化学奖也颁给了 CRISPR 基因编辑技术 。 随后 ， 多项 CRISPR-Cas9 基因编辑临床实验开启并获得突破性结果 ， 并已成功应用于人类疾病的治疗 。 与 Cas9 蛋白不同 ， Cas13 蛋白特异靶向 RNA 序列 ， 能够在切割靶 RNA 之后仍保持活性 ， 而且可能表现出不加区别的切割活性 。 这一特性使其不能被用于基因编辑 ， 但对诊断来说却是个独特的优势 ， 例如通过切割降解已标记的核酸来产生荧光信号 ， 具有被应用于核酸检测的潜力 。 2021 年 8 月 5 日 ， 加州大学伯克利分校Jennifer Doudna（2020 年的诺贝尔化学奖得主之一）、David Savage和Patrick Hsu三位科学家领导的研究团队在Nature Chemical Biology杂志上在线发表了题为Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases的文章 。 研究人员结合了两种不同的 CRISPR 酶 ， 创造了一种能在一小时内检测到少量病毒 RNA 的方法 ， 这种被称之为快速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem FIND-IT）的无扩增技术 ， 可以为许多传染病及当前流行的 COVID-19 提供快速且廉价的诊断策略 。
主要研究内容LbuCas13a 结合嗜热栖热菌 Csm6（TtCsm6）可用于快速 RNA 检测Csm6 是一种 III 型 CRISPR-Cas 系统的 RNA 内切酶 ， 可被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子 ， 基于其信号放大的内源性功能 ， 有可能提高 RNA 检测的敏感性 。 通过筛选 ， 研究人员发现寡核苷酸 A4-U6可结合并刺激 TtCsm6 对报告蛋白的切割 ， 并释放出荧光分子 。 此外 ， 不同浓度的 A4-U6激活 TtCsm6 后 ， 在 20-30 分钟内出现荧光增长 ， 随后达到一个平台值 ， 最终荧光水平与 Csm6 激活剂的数量成正比 。 在荧光已经趋于平稳的 LbuCas13a-TtCsm6 反应中加入 A4-U6激活剂可以迅速增加 TtCsm6 对靶序列的切割 ， 而添加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 则没有影响 。 这些数据表明Csm6 的 A4>P 配体会随着时间的推移而耗尽 ， 从而使其 RNA 切割活性失活 ， 而这种失活则限制了其产生荧光信号的数量 。
Csm6 激活剂的化学修饰为了解决 Csm6 激活剂失活的难题 ， 他们想到了位点选择性化学修饰的方法 ， 实验结果发现 ， 这种策略不仅可以防止激活 Csm6 的寡核苷酸的降解 ， 同时还能保持 Csm6 的高水平激活状态 ， 使其可以反复切割和释放与 RNA 相关的荧光分子 。 灵敏度比未修饰的 A4-U6激活剂提高了 100 倍 。
RNA 检测的可编程性为了使 TtCsm6 及其修饰的激活剂能够用于提高 RNA 检测的灵敏度和检测速度 ， 必须保留用于串联检测的 CRISPR 核酸酶的可编程特性 。 为此 ， 他们将 TtCsm6 及其激活剂添加到一个 LbuCas13a 蛋白中 ， 该蛋白具有不同的 crRNA 序列 ， 可以靶向 COVID-19 病原体 SARS-CoV-2 的 RNA 序列 。 采用不同的 crRNA 序列进行检测 ， 发现其具有相似的灵敏度和动力学 ， 这表明 ， 这种「一步法」可以对不同的 crRNA 序列进行编程 ， 因此可能适用于几乎任何 RNA 序列的检测 。
为了确定添加 TtCsm6 是否能加快检测时间 ， 他们在反应 20 分钟后比较了这两种检测策略的结果 ， 发现同时含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的试剂盒在 20 分钟内即可完成对每微升 31 个拷贝的样品检测 。 综上这些结果表明 ， 通过优化 LbuCas13a 的 crRNA 和化学修饰的 TtCsm6 激活剂 ， 串联 CRISPR 核酸酶检测能够实现对传染性病原体 RNA 序列的无扩增检测 ， 在加速检测病原体的同时兼具高灵敏度 ， 他们称这种策略为快速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem FIND-IT） 。
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