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纳米 具有键合缺陷放大修饰策略的基于共价有机框架的球形核酸探针( 二 )

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杂交实验
将不同浓度的核酸靶标 (0–400 nM) 添加到 COF-c-myc 溶液 (200 μg/mL) 中 。 在 37°C 下孵育 30 分钟后 ， 检测溶液中 Cy3 的荧光信号 。
动力学实验
将终浓度为 220 nM 的核酸靶标加入 COF-c-myc 溶液 (200 μg/mL) 中 ， 收集溶液在 0-60 分钟时 Cy3 的荧光信号 。
特异性测定
将不同的靶标（即 Tc-myc、T-21、T-221 和 T-TK1）加入到 COF-c-myc 溶液中 ， 并将混合物在 37°C 下孵育 30 分钟 。 然后 ， 收集不同溶液的 Cy3 的荧光信号 。
抗酶消化实验
将 DNase I (2 U/L) 添加到 COF-c-myc 溶液中 。 在混合溶液的 0、1、2、3、4 和 5 小时收集 Cy3 的荧光信号 。5.5 h加入Tc-myc ， 37℃保温30 min ， 进一步检测Cy3的荧光信号 。
抗 GSH 和抗蛋白质干扰试验
将 COF-c-myc 分散在 PBS 溶液中 ， 然后将其分为三组：PBS、谷胱甘肽 (5 nM) 和牛血清白蛋白 (BSA) (1 mg/mL) 。 然后 ， 将相关的 c-myc 靶标加入溶液中 ， 在 37°C 孵育 30 分钟后检测 Cy3 的荧光信号 。
MTT检测
MCF-7细胞接种于 96 孔板中 ， 37 ℃培养 24 h 。 然后 ， 弃去培养基 ， 将含有不同浓度 COF-c-myc（20、40、60、80 和 100 μg/mL）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 培养基加入孔中 。 孵育 12 和 24 小时后 ， 用 200 μL MTT (0.5 mg/mL) 置换溶液并进一步孵育 4 小时 。 最后弃去MTT溶液后 ， 每孔加入200 μL DMSO ， 酶标仪检测490 nm处的吸光度 。
共聚焦成像分析
MCF-7和 MCF-10A 细胞接种在共聚焦培养皿中 ， 并在 37°C 下孵育 24 小时 。 然后 ， 将COF-c-myc纳米探针加入每组（100 μg/mL）并孵育4小时 。 然后 ， 将细胞用PBS洗涤3次并使用共聚焦激光扫描显微镜进一步成像 。
流式细胞术分析试验
MCF-7和MCF-10A细胞接种于细胞培养皿中 ， 37℃培养24小时 。 然后 ， 将COF-c-myc纳米探针加入每组（100 μg/mL）并孵育4小时 。 然后消化细胞 ， 用PBS洗涤3次 ， 再分散于50 μL PBS中 。 最后 ， 使用成像流式细胞仪分析细胞 。
结果和讨论
基于 COF 的 SNAP 的设计、制备和表征
SNAPs是一种新型核酸结构 ， 以纳米颗粒为核 ， 致密核酸为壳 。 (23-28) 这些纳米结构具有增强的稳定性和更好的诊断和治疗性能 。 (2930) 例如 ， 与游离核酸分子相比 ，SNAPs 的酶抗性作用更强 。 (3132) SNAPs 具有更好的细胞摄取效果 ， 可以在不使用转染剂的情况下实现有效的细胞内生物标志物检测和药物递送 。 (33-36) 因此 ， 大量基于不同的对应物(37-39) 类似于金属-有机框架 ， (40-52) COFs 具有许多有吸引力的结构和功能特性 ， (53-68) 基于 COF 的 SNAPs 可能是用于治疗诊断应用的新型纳米材料.然而 ， 将致密的核酸分子直接移植到 COF NPs 上具有挑战性 ， 因为不仅 COFs 上用于固定核酸分子的连接位点有限 ， 而且 COF NPs 与核酸骨架之间的强相互作用导致随机吸附这些分子转移到 COF NPs 上 ， 使得很难用所需的空间排列来装饰高密度的核酸分子以形成 SNAP 。
最近提出了 BDF ， 它可以直接修饰 COF ， 而不需要包含额外基团的接头 。(19) 然而 ， 由于 COF 上的缺陷密度低且分布不可控 ， 因此通过 BDF 制备基于 COF 的 SNAP 是不可行的.在此 ， 我们提出了 BDAM 策略 ， 旨在用包含多个基团的分子作为桥接剂来放大 COF 的缺陷 。 随后 ， 功能分子很容易通过第二个反应步骤装饰到缺陷放大的 COF 上 。 以PAA为模型桥分子 ， 卟啉COF NPs为核心 ， 氨基和Cy3双末端c-myc发夹结构为壳 ， 轻而易举地开发出第一个基于COF的SNAP（COF-c-myc） 。 事实证明 ， COF 是由 Tph 和 Dha 成功制备的（图 S1） ， 其包含出色的晶体结构 ， 可以成功研磨成具有均匀尺寸分布的均匀 NP（图 1A、B） 。COF NPs 在 3.5°（100 面）附近降低的峰强度应归因于 COF 的长程有序度的降低 。 根据傅里叶变换红外（FT-IR）光谱 ， 证明了成功的 PAA 改性 ， 表明 BDAM 的可行性（图 S1） 。X 射线光电子能谱 (XPS) 的结果表明 ， 由于成功的 DNA 修饰 ， COF-c-myc 中的 P 含量升高（图 1D、E） 。COF-c-myc 的紫外可见光谱在 260 nm 附近显示出明显的核酸吸收峰（图 1C） ， 同时表面 ζ 电位的变化和 DLS 尺寸略有增加（图 1F 和 S3） ， 进一步证明了每一步都准备充分 。 根据标准曲线 ， COF-PAA NPs 上的 DNA 连接含量计算为 0.695 nmol/mg ， 明显高于 COF NPs 直接吸附的密度（0.219 nmol/mg）（图 S2） 。
图 1. COF-c-myc 的制备和表征 。(A) COF 和 COF NPs 的 PXRD 模式 。(B) COF NPs、COF-PAA 和 COF-c-myc 的透射电子显微镜 (TEM) 和扫描电子显微镜 (SEM) 图像；比例尺：500 nm 。(C) COF、COF-PAA 和 COF-c-myc 的紫外-可见光谱 。(D) COF NPs 和 (E) COF-c-myc 的 XPS 模式 。(F) COF NPs、COF-PAA 和 COF-c-myc 的 DLS 尺寸分布 。

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