实验|知识分享：AAV自噬双标病毒_细胞系|乙醇胺|噬体|Vigene|细胞

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一．关于自噬及LC3
1. 自噬
大自噬（macroautophagy），也就是通常说的自噬（autophagy），是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分（细胞器、蛋白等）被双层膜的囊泡包裹，形成自噬体（autophagosome），进而传递到溶酶体进行降解的过程。详细来说，自噬过程与内涵体途径（endolysosomal pathway）密不可分（见图1）。一方面，自噬体能够与晚期内体（late endosome）融合形成中间囊泡（amphisome）最终形成自噬溶酶体（autolysosome）；另一方面，自噬体能够直接与溶酶体（lysosome）融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径，自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。
细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下，可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响，从而防止某些疾病的发生（如神经退行性疾病和癌症）。饥饿等也可诱导自噬的发生，通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。

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图1 自噬过程及其与内涵体途径的关系
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen ， BMC Biology ， 2011)

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2. LC3
LC3（light chain 3）简称于MAP1LC3(microtubule-associated proteins light chain 3) ，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。
LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的LC3-I 。在自噬过程中， LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合，形成LC3-II并定位于自噬体膜上（见图2）。哺乳动物中的LC3可分为三种： LC3A、LC3B和LC3C 。其中， LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。

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图2 LC3在自噬体形成中的作用
(Varuna C.Banduseelaet al ， Phyciological Genomics ， 2012)
二．自噬流检测方法
细胞经自噬诱导或抑制后，需对自噬流的水平进行观察和检测，常用的技术手段见表1：

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表1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总
（Mizushima et al, Cell, 2010）
其中，电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限；而由于自噬过程发生快速，通过IB/WB检测LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到实验进行时长的影响。
想要准确检测自噬流的变化，需要多种技术手段共同使用，才能达到理想的实验效果，产生具有说服性的实验结果。

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三．维真生物自噬双标病毒产品
维真生物 mCherry-GFP-LC3B腺病毒
维真生物 mCherry-GFP-LC3B慢病毒
维真生物 mCherry-GFP-LC3B腺相关病毒
四．维真生物自噬双标系统的工作原理
未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中，由于mCherry与GFP共同表达，细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭，而mCherry不受影响，进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多，绿色荧光越少，则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻（见图3）。

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图3 mCherry-GFP-LC3B双标系统工作原理
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen ， BMC Biology ， 2011)

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图4 维真生物自噬双标病毒载体图谱
五．维真生物 mCherry-GFP-LC3B自噬双标操作方法
（一）体外实验
以2型AAV病毒为例，维真生物为您推荐的MOI值104-105 ，是根HEK293细胞得出的数据，不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议您感染目的细胞前，进行预实验摸索最佳MOI值，推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。
1. 为了节省病毒，推荐使用96孔板进行预实验。
2. 将目的细胞接种于96孔板中，细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保证细胞贴壁过夜。
3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:10稀释（10-1），以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7 。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。
4. 取出提前准备好的96孔板，先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基，注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。
5. 在加入病毒稀释液后，请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适，是否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化，即所加病毒对细胞没有毒性，可以继续培养。
6. AAV病毒对细胞的感染较慢，请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。
另：如果您选择的产品没有荧光标签请在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达。
注：由于AAV组织特异性，体外感染细胞的效率比较低，所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验。
（二）体内实验
针对小鼠/大鼠来说，研究不同的方向有不同的AAV注射方法，详情可查阅维真生物官网。
六．常见问题解答
1.重组AAV 安全吗?
迄今为止，未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV ，在无需辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成。 Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。
2.哪些血清型的 AAV 可供选择？我该选用哪种AAV呢?
目前为您提供的AAV 血清型为AAV1 ， AAV2 ， AAV5 ， AAV7 ， AAV6 ， AAV8 & AAV9 。请参阅下面指南中参考文献的建议。

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请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表，以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。
3.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?
rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。
4.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体?
纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后， -80℃下长期保存。
5.订制AAV服务，客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?
您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选，或者提供您的质粒DNA或DNA序列，我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。
基因沉默服务，请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。
通常情况下，可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL 。也可根据客户的需要，提供特定体积和滴度的产品。
附：维真生物自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图

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【实验|知识分享：AAV自噬双标病毒】

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