实验|知识分享：mRNA的分离和纯化

2021-05-15 设计洗涤帽子实验基因体积现货 Poly 纯化 纤维素 mol 注射器 NaCl oligo 盐浓度 RNase 琼脂糖

【实验|知识分享：mRNA的分离和纯化】

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实验原理
从细胞或组织中得到RNA是一种混合物，其中包括tRNA ， rRNA和mRNA ，其中RNA为75％～ 85％， tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表达丰度也不一样。每克细胞可分离出5-10mg RNA 。
真核生物mRNA具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴。绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20-300个腺苷酸组成的poly（A）尾，这种结构为真核mRNA分子的分离和纯化，提供了极为方便的条件，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的实验理论就在于此。
一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’端含有poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下， mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中， mRNA可被洗下，经过oligo(dT)纤维素柱吸附和解吸附，即可得到较纯的mRNA 。
实验材料
1、0.1mol/L NaOH （用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）
2、寡聚Oligo（dT）-纤维素
3、加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6) ，每组250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS 。（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）
4、洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6) ，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS 。（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）
5、5 mol/L NaCl（加0.1% DEPC处理过夜）
6、3 mol/L NaAc pH5.2（加0.1% DEPC处理过夜）
7、无RNase双蒸水(DEPC水)
8、70%乙醇（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）
需要用到的实验仪器：恒温水浴箱，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，巴斯德吸管，玻璃棉， 5ml一次性注射器。
实验过程
（一） oligo(dT)纤维素的预处理
1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入填有经DEPC水处理，高压灭菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床约0.5-1.0mL ，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。
3、用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0 。
4、将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL ，保存在4℃待用。
（二）总RNA浓度的调整
1、把总RNA液转到适合的无RNase离心管中，测定总RNA的浓度。如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL ，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL ，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。浓度调整以后，把RNA溶液置于65℃水浴加热5 min ，然后迅速插在冰上冷却。
2、加入一定体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L 。
（三） mRNA的分离
1、mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15min 。 oligo(dT)-纤维素与RNA所需量如下表。
表1 总RNA量所需材料的体积

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2、转移：取1个5ml注射器，用经过高温灭菌的玻璃棉塞紧注射器前端，注射器固定在无RNase的支架上，把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液加入注射器中，把塞子推到底部，收集流出的液体，即把含有未结合上的RNA液体收集到无RNase的离心管中（保留至确定获得足够的mRNA）。
3、洗涤：根据表1所需洗涤缓冲液1的体积，直接用注射器慢慢吸取，温和振荡，充分悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推动塞子，用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260 ，当洗出液中OD值为0时准备洗脱。
4、洗脱：根据表1所需洗脱液体积，用注射器慢慢吸取洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内，充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素，推动塞子，以1/3至1/2柱床体积分装到无RNase的离心管中。
5、测定每一管的OD260 ，合并含有RNA的洗脱液。在4℃条件下， 2500g ，离心2-3min ，将上清转移至新无RNase的离心管中。
6、沉淀：向上清液中加入1/10体积的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后， -20℃条件下沉淀30min或放置过夜。
7、离心收集：4℃条件下， 12000g, 离心15min ，小心弃去上清，用70%乙醇漂洗沉淀， 4℃条件下， 12000g, 离心5 min ，小心弃去上清液。沉淀空气干燥10min 。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于后续实验，或用70%乙醇溶解，贮存于-70℃ 。
8、定量：测定OD260和OD280 ，计算产率以及OD260/OD280的比率

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注意事项
1、整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境，且注意操作中的低温要求。
2、用于纯化的总RNA样品须尽量保持RNA完整，不能被降解，获得完整mRNA质量的前提条件。
3、总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，若总RNA会影响mRNA纯度。
4、RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5min ，其作用：（1）破坏mRNA的二级结构，特别是poly(A+)尾处的二级结构，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。
5、应注意mRNA不能被DNA污染，否则严重影响实验结果。
6、mRNA制备后，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状，无明显区带，但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内呈弥散状。经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留，但一般来说不会对后续实验造成很大的影响，如果样品纯化后量足够，可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次，进一步提高其纯度。
7、为防止mRNA降解，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存。也可将mRNA用70%乙醇溶解，在-70℃保存，保存时间在一年以上。
8、Oligo(dT)-纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3) ，放在4℃冰箱保存。经过预处理后可以重复使用。

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