癌症|医学魔改大师玩跨界，CRISPR遇见分子诊断科学|人类|博士|原核生物|基因

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引言 2020年，瑞典皇家科学院将诺贝尔化学奖授予Jennifer Doudna教授和Emmanuelle Charpentier博士以表彰她们在CRISPR/Cas9基因编辑方法上所做出的贡献。得益于此，基因疗法随之大放异彩，在很短的时间内完成了由基础理论到初步科学验证，再到实际应用的快速发展。但这一科学技术却也一直伴随着争议的声音[i] ，给人无限遐想的同时，也带来一些隐忧。瑕不掩瑜，这些暂时的争议阻挡不了人类对于这一充满潜力的新技术扩展应用的尝试。近年来，以基因编辑而闻名的生物技术正被用于开发便携式、家庭式的传染病和癌症测试等分子诊断领域。 CRISPR/Cas的神秘面纱正在被缓缓揭开。
安永生命科学与医疗健康行业课题组对话专家，带你走近：CRISPR/Cas基因编辑遇见分子诊断。
专家介绍
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张明东博士
现任波士顿科学亚太区首席医务官及医学事务和卫生经济副总裁
前美国食品药政管理局医务官和流行病学家
曾任职香港中文大学医学院教授
美国国立卫生研究院国立癌症研究所博士后
美国贝乐医学院分子病毒学博士
“CRISPR/Cas技术是一种逆天改命的手段，让人产生很多瑰丽和美好的遐想。 ”

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王弢博士
中国抗癌协会肿瘤标志专业委员ctDNA技术专家委员会副组长
江苏省肿瘤分子诊断工程技术研究中心主任
苏州大学（特聘-产业方向）教授
复旦大学医学博士
“CRISPR的应用，起步于医学，终将不止于医学。 ”
对话专家 Q1：CRISPR/Cas一直存在争议，您建议安永公众号的读者如何正确理解这一技术？
张明东：
CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列。 Cas基因则位于CRISPR基因附近，或散布于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被叫做CRISPR关联基因，即Cas 。
生命进化史上，某些细菌为了将入侵的病毒基因清除，进化出CRISPR/Cas基因剪切防御系统，能够在遭到病毒入侵后，把病毒基因的一小段存储到自身 DNA 里称为 CRISPR 的存储空间中。这样，当病毒再次入侵时，细菌便可以根据存储的片段识别病毒，并将病毒的DNA切断达到抑制作用。这一机制真正体现了生命之间的微妙平衡，相生相克又不断进化。
CRISPR/Cas技术的发明，为临床医学提供了超越以往的工具。原本不可治愈的疾病有了治愈的可能，比如基因变异导致的各类型遗传疾病、HIV等难以根治的病毒感染，糖尿病易感性人群的基因改造等，甚至还有可能成为更有效的癌症治疗手段。不夸张地说， CRISPR/Cas技术可以被称为是一种逆天改命的手段，让人产生很多瑰丽和美好的遐想。
然而，重大的科技发现常常伴有不容忽视的两面性。火药的发明，不仅带来矿产开发、道路建设等生产力的提升，也招致枪械带来的巨大人员伤亡；20世纪最伟大的发现“相对论” ，开启了高效、清洁的核能应用，却也让人们笼罩在原子弹的阴霾之下。对CRISPR基因编辑技术来说，它使科学家拥有改造人类疾病基因或消灭生物的能力，也带来不受伦理管控下生物武器泛滥甚至畸形生物变异的可能性。这一技术发明无疑是人类自火器时代到核能时代以来所面临的最严峻挑战。
王弢：
CRISPR技术开启了基因编辑的大幕！这是一项了解生命本质、挽救生命甚至创造生命的革命性技术，期待在全球科学技术人员的不懈努力下，发挥它最大的价值，逐步实现让人类远离众多疾病折磨，实现更健康和更长寿生活的更多应用。 2020年新冠疫情突然爆发，恰此时mRNA疫苗大获成功， mRNA治疗药物获得快速发展。突破性的生物技术不断涌现， “21世纪是生物技术时代”的预言正在成为现实。 ”
诚如明东博士所言，作为这个时代光彩夺目明珠的CRISPR有两面性，如何防范这个魔法无穷的工具不被恶意群体肆意滥用，是人类大家庭必须直面的共同课题。我始终相信，每一次技术突破的洗礼，带给人类的不仅是生产力的巨大提升，更是人类不断认知自然和自身的过程，相信在CRIPSR等生物技术的加持下，人类将会拥有更美好的家园。
Q2：对于11月12日《Nature Communication》上发表的关于CRISPR/Cas9基因编辑或许会让细胞产生与癌症相关的基因突变形式，您觉得对产业界的影响是什么？
张明东：
CRISPR技术自问世以来，就获得“基因魔剪”的称号，在医学科研领域可以说是百花齐放、硕果累累，同时在农业、环境等领域也展现了光明的前景。 2020年发现CRISPR/Cas技术的科学家Jennifer Doudna教授和Emmanuelle Charpentier博士荣获诺贝尔化学奖，这是诺贝尔奖历史上少见的从发现到获奖仅数年的现象，也说明这是一项多么重要的发现。
近期，数篇Nature子刊文章提示， CRISPR会在体内引起不可预测的的脱靶效应，甚至癌症相关的突变。因而， CRISPR技术到底是“魔剪”还是“乱剪” ，一时众说纷纭。从CRIPSR技术偏靶造成的异常突变而言，这只是这项革命性技术在应用中的一个插曲，说明现在的CRISPR编辑技术还不够精准，还需要更多优化。需要进一步优化到单碱基编辑，优化到特定部位的单碱基编辑，实现更精细精确的基因编辑操作。所以我想，大家不要因为目前CRISPR技术有一些瑕疵，就下结论说它多么不堪或者多么危险。这些瑕疵是完全可以克服的，只是时间长短的问题。
王弢：
CRISPR技术出现后，作为一项通用的技术，在实际应用的领域或方向必然存在一些瑕疵，这是十分正常的，需要的是科研人员不断尝试、不断改进，逐步实现产业应用。如果都是一路顺风，我想那才是需要每个人担心的。每个细分方向或具体疾病应用的CRISPR关键细节技术的开发，需要再多一点时间，我们会看到更多的实际结果，可能许多不可治疗的疾病都将变为可治愈的疾病，这一天并不遥远。总体而言， CRISPR的应用，起步于医学，终将不止于医学。

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Q3：能否谈一谈CRISPR技术目前较为成熟的医学应用领域，在哪些方面为人类带来福音？
张明东：
目前进展明显的治疗领域，主要包括：
1. 癌症治疗，主要针对免疫细胞改造，突变细胞的基因修补或切除等，有多个临床研究，部分获得积极的结果。
2. 遗传疾病，比如亨廷顿氏舞蹈症病(Huntington ' s disease)、杜氏肌营养不良症（DMD基因）等已有研究报道，进展到临床II期及之后也有报道，但还需要公布相关临床数据。
3. HIV等病毒的体内整合感染方面的应用，我想这是近期科研人员比较有把握会有重要进展的领域，值得大家关注。
王弢：
在医学诊断领域， CRISPR-based核酸检测技术最有可能成为新一代的分子诊断平台，尤其在远离PCR实验室场景下的应用。
医学诊断是现代医学发现疾病的入口，提供了疾病的快速预警和精准诊断，让治疗有针对性的明确目标。数十年来，核酸检验领域，真正得到广泛应用的技术仅有PCR和NGS ，它们当中一个实现了单靶标或少靶标检验，一个实现了多靶标并行检验。两者都依赖于大型医学检验实验室、专业操作和大型仪器的应用场景，是一种远离疾病人群个体和现场的检验。
而快速准确诊断感染性疾病应用是目前紧迫的需求，是指导疫情防控，保障公共卫生安全，避免大范围传播的关键。这一点无论是对大型医疗中心，还是在缺医少药的基层医疗卫生机构，或是欠发达的国家和地区都至关重要。理想的诊断方式应该价格低廉、准确性高、快速、操作简便（无需专业人士操作）以及无需专业设备和基础设施要求。
从我个人的意见以及我们的实践来看， CRIPSR-based核酸检测技术是第一个能真正实现精确、现场甚至居家自测的医学应用级诊断平台。

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Q4：如何认识CRISPR-based诊断技术，它有哪些重要突破？能否谈一谈该技术目前较为成熟的应用领域，在哪些方面为人类带来福音？
张明东：
CRISPR/Cas技术以出众的基因编辑能力闻名于世，但显然它的技术应用范围绝不仅限于基因编辑。 CRISPR/Cas技术的创立者之一Jennifer Doudna教授早在2017年就将该技术应用于RNA检测，创办Mammoth Biosciences公司，利用Cas12a的非特异性ssDNA降解能力开发出新的核酸快速检测方法。几乎同时， CRISPR研究先锋者之一的华人科学家张锋教授于2017年创办Sherlock BioSciences公司，利用Cas13蛋白的天然RNase活性改进，建立了快速核酸检测SHERLOCKTM（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter unlocking）平台。
2021年，基于CRISPR检测平台被美国《Science》杂志誉为“下一代分子诊断技术”! CRISPR颠覆传统医学：一张纸、几分钟，即可诊断疾病！该技术将在病原检测、疾病筛查、精准医疗等众多领域展现巨大的应用潜力。
王弢：
Mammoth Biosciences的“DETECTR BOOST”技术平台，可在30分钟内获得诊断结果。 Sherlock Biosciences开发了首个获美国FDA紧急使用授权的基于CRISPR技术新冠病毒测试，被评为2021年“全球最具创新力10大生物技术公司”之一。
在国内，有多家生物技术公司参与开发了CRISPR-based核酸检测技术的新冠病毒诊断产品，主要还是集中于医学实验室场景下的操作。为真生物开发了恒温扩增+CRISPR联合应用的小型化单人份装置，首次实现基于CRISPR新冠病毒核酸的单人自测或现场快检，除应用于国内渠道外，也在积极申报美国FDA紧急使用授权（EUA）。
CRISPR-based快速检测可实现各类微生物的居家自测或现场检验，类似于现在家用的血糖监测。我想，在不远的将来，一种全新的医疗形态将会逐步呈现。
张明东：
目前CRISPR-based核酸检测技术具有明显的高灵敏度和高特异性的优势，已实现1copy/μL检测，甚至高于常规的荧光PCR ，在病原体检测如SARS-CoV-2检测方面已实现临床应用。
应用上面，新CRISPR测试能够节省时间和金钱，甚至不再需要去看医生就能做出诊断。这种诊断可以在几分钟内得出明确的阳性或阴性结果，类似于家庭怀孕自测。测试结果可以通过手机上的应用程序发送给医生，医生可以立即开出处方或给出治疗建议。这些测试还可以在医院使用，以快速确定感染病原体，以及引起肿瘤的突变基因，或者快速预测人们是否有罹患某种疾病的遗传基因。
Q5：相比qPCR技术， CRISPR核酸检测技术主要有哪些优势？CRISPR核酸检测技术产业化尚需解决的核心问题有哪些？从国外的技术和临床试验对比来看，国内CRISPR核酸检测技术正处于怎样的发展阶段？
王弢：
相比qPCR ， CRSIPR核酸检测技术拥有独特优势：
1. 复杂背景下的高灵敏度，可对aM（10-18M）浓度的靶核酸分子进行高效检测；而qPCR技术很难实现复杂背景下靶分子的有效扩增。
2. 复杂背景下的高特异性。 CRISPR核酸检测技术具有极为优异的抗干扰性能，可实现对单碱基异常的精确监测；qPCR影响因素多，抗干扰能力差，难以避免假阳的存在。
3. 更为简易的操作，无需依赖较大的仪器， 10-60分钟内完成扩增全程；qPCR依赖多步骤的复杂操作，严格环境控制，耗时1-3小时，需要复杂的大型精密仪器。
张明东：
CRISPR核酸检测技术具有高灵敏度、高特异性和极为显著的抗干扰等优势，但如何实现核酸预扩增和CRISPR一体化反应是一个难题，以及如何实现单人份或高通量快速检测也是不同场景下应用的需要，还有各种关键生物酶的产业化是需要解决的核心问题。
王弢：
国内CRISPR核酸检测技术的发展处于快速发展的起步阶段，整个产业链还不是很成熟。成熟的CRISPR核酸检测技术如果应用于院外场景，需做到：
1. 快速，通常1小时内完成检测。
2. 防污染，全封闭操作。
3. 高性能，灵敏度和特异性高于或等同于qPCR 。
4. 便捷，各检测试剂All in于一管。
5. 常温储运。
结束语基因组中的微小改变，会带来有机体的巨大变化。随着科研人员对生命系统的研究不断深入和资本市场的强力支持，我们有理由相信，在不远的将来，我们将会看到CRISPR/Cas更加广泛、成熟地运用于临床，有效治疗各种遗传疾病。但值得警惕的是，这项革命性的技术也是一把双刃剑，只有完善相关法律法规，厘清科技与伦理的边界，规范科研行为，才能引导基因编辑领域的健康发展。
参考资料
[i]. 近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“A systematic genome-wide mapping of oncogenic mutation selection during CRISPR-Cas9 genome editing”的研究报告中，来自美国国立卫生研究院等机构的科学家们通过研究发现，基于CRISPR/Cas的基因编辑（尤其是基因敲除）或许会让正常细胞产生与癌症相关的基因突变形式， “基因剪刀”再引争议。
本文中的观点仅代表受访者个人观点，并不一定反映安永全球机构或其成员机构的观点。

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生命科学与医疗健康行业课题组
*安永研究院是应用于安永商务技能培训（上海）有限公司的知识枢纽品牌概念
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