近年来 ， 转录组研究开始进入空间转录组（spatial transcriptome）阶段 ， 该技术可以同时获得细胞的空间位置信息和基因表达数据 ， 推进了对组织原位细胞真实基因表达的研究 ， 为组织细胞功能、微环境互作、发育过程谱系追踪、疾病病理学等多个领域提供了重要的研究手段 。
图表3 3种不同的转录组技术
几十年来 ， 在空间水平研究组织基因表达的技术层出不穷 。 根据原理不同 ， 可以分为4类：基于原位杂交的空间转录组技术、基于高通量测序的空间转录技术、基于原位测序的空间转录组技术和基于活细胞标记的空间转录组技术 。
图表4 空间转录组方法的细胞和基因的分辨率
1.基于原位杂交的空间转录组技术
随着技术的发展 ， 使用荧光标记的探针与预定的靶RNA杂交 ， 荧光体系可进行定性、定量或相对定位分析 ， 这一技术称为荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization FISH) 。
2012 年 ， Eric Lubeck 等通过结合超分辨显微镜（super-resolution microscopy ， SRM）和组合标记 ， 识别单个 mRNA 上不同荧光寡核苷酸探针的空间排序 ， 大幅提高了检测的转录本数量 。
虽然 ， 组合标记smFISH 增加了可识别的转录本数量 ， 但是 ， 还无法检测全基因组的转录本 。 2014 年 ， Eric Lubeck等开发了顺序杂交技术 。 原则上 ， 4 种荧光染料和 8 个杂交回合可以检测一个细胞中的所有转录本 。 这种方法的好处在于即使只有 2 种荧光染料 ， 也可以通过多次杂交使得检测规模迅速扩大 。 但是 ， 如果想要将这种方法的应用范围扩大到整个转录组 ， 价格较昂贵 。 除此以外 ， 检测误差也呈指数增长 。
图表5 基于原位杂交的空间转录组技术原理
2015年 ， 美国哈佛大学华裔生物物理学家庄小威教授基于smFISH技术 ， 研发出单分子成像技术(multiplexedError-robust fluorescence in situ hybridization MERFISH) ， MERFISH采用经过四轮杂交 ， 4个荧光成像通道(Alexa Fluor、Cy5、AlexaFluor和ATTO) ， 能够在细胞中分析数百至数千个RNA 。 虽然MERFISH解决了耗时的缺点 ， 减少了杂交后的背景荧光干扰 ， 但还是存在多轮杂交后背景影响荧光的现象 。 MERFISH也在不断升级 ， 其检测效率明显提高 。
2.基于高通量测序（NGS）的空间转录组技术
（1）LCM-RNAseq 技术
1996 年 ， Emmert 等开发了激光捕获显微切割技术（laser capture microdissection ， LCM） ， 该技术可以在保留空间位置信息的前提下 ， 可视化地从切片中快速且准确地捕获目标细胞 ， 已广泛用于生物学研究中 。 该技术原理是将组织切片贴在特殊薄膜覆盖的玻璃载玻片上 ， 组织切片经过染色后 ， 在显微镜下可视化地进行特定细胞的选择、激光切割和分选 ， 收集组织中特定的细胞样品 。 2016 年 ， Peng等通过整合与优化LCM 和单细胞 RNA-seq 技术 ， 构建了一种能解析少量细胞转录组信息 ， 同时保留细胞原有位置信息的方法 。
（2）HDST 和 Slide-Seq
2019年Stahl 等提出了高分辨空间转录组（High-definition spatial transcriptomics ， HDST）测序方法 ， 通过在载玻片表面雕刻 2.05 μm 的大量小孔 ， 将直径为 2μm 的硅胶磁珠分配到这些孔里 ， 通过在磁珠表面连接带有特定 barcode 序列以及多种 UMI 和 poly-dT 的寡核苷酸链 ， 来捕获对应位置细胞的 mRNA 进行反转录 ， 并进行文库构建和转录组测序 。
同一时期 ， Macosko等发明了类似的 Slide-Seq 方法 。 在Slide-seq中 ， 首先在涂有橡胶的玻璃盖玻片表面填充一层10 μm的特异性条形码微珠（beads） 。 与其他高通量scRNA-seq方法中使用的微珠类似 ， 每个微珠上条形码是随机分布的 。 因此 ， 先对每个微珠上寡核苷酸条形码进行识别 ， 再进行混合测序 。 为解决这一问题 ， Slide-seq后续利用SOLiD化学技术（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）来读取每个柱子上不同条形码 。 先识别每个10 μm捕获点（spot）中特异性空间标识符 ， 再行RNA-seq ， 因此寡核苷酸捕获的mRNAs可以映射回它们的原始空间坐标 。
这两种方法通过结合测序数据和图像处理 ， 都可以将基因表达情况可视化地比对到原始的组织切片中 ， 得到非常直观的结果 ， 通量大且分辨率高 。 但其存在一定比例的磁珠会同时比对到两种细胞类型的情况 ， 且磁珠的捕获效率仍然有待提高 。
（3）10x Genomics Visium 空间转录组测序技术
2016年 ， 瑞典皇家理工学院Joakim Lundeberg在Science上发文 ， 利用基因芯片技术将位置信息保留在芯片上 ， 再利用二代测序技术对组织中RNA进行测序 ， 从而生成组织切片上完整的基因表达图像 。 2018年底 ， 10X Genomics宣布收购Spatial Transcriptomics ， 并于2019年11月发布Visium空间基因表达解决方案 。
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