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基于微镜阵列的单透镜薄片荧光显微镜( 二 )

陨石 太空望远镜


3单透镜LSFM的实验配置
实验配置如图2a所示 。 LSFM中的光片是通过一维扫描电流计扫描贝塞尔光束形成的 ， 这可以提高LSFM的空间分辨率 。 与高斯光片相比 ， 贝塞尔光片的最大优点是可以提供足够的照明范围 ， 从而有效利用MMA的阵列检测能力 。 在我们的方法中 ， 连续波激光产生的高斯光束通过轴棱锥变换为贝塞尔光束 ， 然后用一维扫描电流计生成“光片” 。 通过相同的目标实现照明和检测 。 将不同轴向位置产生的荧光信号聚焦到不同的微镜上 ， 并映射到科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）上的不同位置 。

图2 a）实验装置示意图 。 b）用一维电流计快速扫描生成数字光片的原理图 。 c） OL的样本激励和信号采集过程 。 绿色箭头表示激发光束 ， 红色箭头表示荧光信号 。 d）信号被传输到MMA ， 并反射到最终侧视摄像头 。 MMA和sCMOS之间的部分在（d）中省略 。 红色箭头表示荧光信号 ， 粉色箭头表示MMA反射的荧光信号 。
4实验结果
在实验中 ， 首次通过成像尺寸约为200 nm的量子点簇来表征该系统的点扩散函数 。 通过拟合量子点团簇的强度曲线 ， 对该系统的分辨率进行了校准 ， 如图3所示 。

图3 单透镜薄片荧光显微镜空间分辨率的量化 。 a） XY平面上量子点团簇的图像 。 粉色线在X方向 ， 绿色线在Y方向；（a）中右上角是代表性量子团簇的TEM表征 。 b）量子点簇在XZ平面上的图像 ， 蓝线在Z方向 。 黄色虚线框中的右下角是（a）和（b）的原始图像；c–e）深蓝色曲线是分别在X、Y和Z维度上的彩色线上的强度分布 。 （c）–（e）以标准化比例绘制 。 每个维度的高斯强度拟合覆盖在相应的行中 。 （e）中显示的两个峰值是由于覆盖两个相邻micr反射镜的细长轴向场分布造成的 。
为了验证贝塞尔光束在实验中的应用 ， 通过快速扫描焦区中的单个金纳米粒子 ， 测量了贝塞尔光束的三维分布 。 使用直径为10μm的荧光微球作为成像样品 。 首先用乙醇稀释微球 ， 然后用紫外线胶将其固定在玻片上 。 图4a显示了一簇两个微球的亮场图像 。 图4b-d显示了示例的三维视图 。 为了抑制理论讨论中提到的实验中的串扰噪声 ， 使用图3中测量的PSF进行反卷积 。

图4直径为10μm的荧光微球的成像结果 。 a）两个直径为10μm的荧光微球的亮场图像 。 b–d）样品分别沿Z、Y和X方向的三维渲染成像；e）显示沿y轴和z轴分别对应于（f）和（g）的横截面切片方向的示意图；f）球体样品的横截面切片（XZ）；g）球体样本的横截面切片（XY） 。 所有比例尺均为10μm 。
细胞成像采用COS-7细胞 。 COS-7细胞系来自非洲绿猴的肾组织 。 它通常用于病毒和转染研究以及细胞基因转录研究 。 选择美国Biotium公司的红细胞1号（RedDot1）作为细胞染色剂 ， 这是一种细胞的远红色核染色剂 。 RedDot1染料在488-678nm波长的激发下发出远红色荧光 ， 发射峰值为694nm 。 细胞的亮场成像如图5a所示 ， 其中可以观察到细胞核和核膜的高浓度区域 。 数据采集和反褶积处理后 ， 荧光成像的3D视图如图5b-d所示 。 沿XZ和XY方向的横截面切片分别如图5f、g所示 ， 其中在高浓度区域可以观察到来自细胞核的更强荧光信号 。

图5 COS-7细胞成像结果 。 a） COS-7细胞亮场图像；b–d）样品分别沿Z、Y和X方向的3D渲染成像；e）显示沿y轴和z轴分别对应于（f）和（g）的横截面切片方向的示意图；f） COS-7样品的横截面切片（XZ）；g） COS-7样品的横截面切片（XY） 。 所有比例尺均为10μm 。
5总结和讨论
总之 ， 我们展示了一种基于MMA的新型单透镜LSFM 。 使用单个高NA物镜进行激发和检测 ， 提高了空间分辨率 ， 使我们的方法与传统的激光扫描显微镜更加兼容 。 此外 ， 使用离散微镜的功能类似于共焦显微镜 。 因此 ， 报告的方法显示出良好的轴向分辨率 。 该方案还可以很容易地与其他成像方式相结合 ， 如受激发射损耗（STED）和晶格光片显微镜 ， 并发现有前景的生物医学应用 。
【基于微镜阵列的单透镜薄片荧光显微镜】来源：Single-Lens Light-Sheet Fluorescence Microscopy Based on Micro-Mirror Array Laser   Photonics Reviews doi.org/10.1002/lpor.202100026

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