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2017年 , 美国 FDA 批准了首款 CAR-T 细胞疗法上市 , 人类进入细胞治疗时代 , CAR-T 细胞疗法在血液类癌症中取得了很好的临床效果 。 目前 , 已上市的几款 CAR-T 疗法都是使用的来自癌症患者自身的自体 T 细胞 , 自体细胞疗法的优势在于能够在患者体内长时间发挥作用 , 且不产生排异反应 , 但该方法也存在着许多局限性 , 自体细胞疗法耗时长 , 一些急性白血病患者没有足够时间等待 , 此外 , 许多病情严重的患者没有足够的 T 细胞用于工程化改造 , 也没有足够的时间来等待改造 。 因此 , 许多研究团队和公司开始致力于开发同种异体细胞疗法 , 异体细胞疗法的细胞来源更多样 , 可以是外周血、脐带血 , 以及人工诱导多能干细胞(iPSC)等等 , 该方法更容易批量生产 , 耗时更少 , 能够解决自体细胞疗法的多种局限 , 也就是所谓的“现货型”细胞疗法 。 以现货型 CAR-T 疗法为代表的同种异体 T 细胞疗法 , 通常使用基因编辑技术(主要是 CRISPR-Cas9)来敲除 T 细胞受体(TCR)及其他基因 , 来避免移植后出现的移植物抗宿主病(GvHD) 。
2022年6月30日 , 以色列特拉维夫大学的研究人员在 Nature 子刊 Nature Biotechnology 发表了题为:Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR–Cas9 cleavage 的研究论文 。 该研究使用单细胞 RNA 测序技术验证了 CRISPR-Cas9 基因编辑人类原代 T 细胞后的结果 , 检测结果显示 , CRISPR-Cas9 编辑的目标基因所在的染色体出现了频繁的染色体非整倍性(染色体数目的增加或减少)和染色体截短 。 这项研究结果表明 , 染色体的非整倍性和截短是 CRISPR-Cas9 切割 DNA 双链后的常见结果 , 因此 , 在使用 CRISPR-Cas9 基因编辑的临床试验中 , 尤其是基于 CRISPR-Cas9 的细胞疗法开发中 , 应当特别注意监测和尽量降低这种潜在的严重染色体变异 。
2020年2月 , CAR-T 之父 Carl June 教授等人在 Science 期刊发表论文 , 报道了首个基于基因编辑的 CAR-T 疗法治疗癌症的人体临床试验结果 。 该研究通过 CRISPR-Cas9 基因编辑敲除了 T 细胞上的 TCR 和 PD-1 , TCR 蛋白的 α 链(TCRα)由 TRAC 基因表达 , 该基因位于14号染色体;TCR 蛋白的 β 链(TCRβ)由 TRBC 基因表达 , 该基因位于7号染色体;PD-1蛋白由 PDCD1 基因表达 , 该基因位于2号染色体 。
图片来自 Science 论文【2】在这篇最新论文中 , 研究团队使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术来敲除人原代 T 细胞的表达 TCR 和 PD-1 的基因 , 而且使用了和上述 Science 论文中同样的 gRNA 来靶向敲除 TCR 和 PD-1 。 然后使用单细胞 RNA 测序来研究编辑后的人原代 T 细胞的结果 。 实验结果显示 , 在基因编辑4天后 , 相当比例的原代 T 细胞出现了染色体异常 。 具体来说 , 9%的原代 T 细胞出现了14号染色体缺失 , 1.4%的原代 T 细胞出现了14号染色体增加 , 表达 TCRα 的基因位于14号染色体 。 9.9%的原代 T 细胞出现了7号染色体截断 , 表达 TCRβ 的基因位于7号染色体 。 而在编辑的第11天后 , 仍有0.9%的原代 T 细胞存在14号染色体缺失 , 进一步证实了这种染色体变异的长期存在 。
【现货型CAR-T疗法的危机:Cas9基因编辑后,T细胞繁现染色体异常】这项研究表明 , 染色体非整倍性(染色体数目的增加或减少)和染色体截断 , 是 CRISPR-Cas9 基因编辑时对 DNA 双链进行切割后导致的常见后果 , 因此 , 在临床应用中 , 应当进行相应的检测并尽量使其风险最小化 。 此前已经有大量研究发现并证实 , CRISPR-Cas9 基因编辑 , 由于 Cas9 造成的 DNA 双链断裂 , 导致细胞出现染色体大片段碱基缺失、染色体碎裂、重排等严重染色体异常 。 这些发现提醒了我们应当加强对 CRISPR 基因编辑技术潜在风险的评估和监测 。 需要指出的是 , 碱基编辑(Base Editing) , 能够在不造成 DNA 双链断裂的情况下进行基因编辑 , 碱基编辑技术开创者刘如谦教授创立的 Beam therapeutics , 以及国内的贝斯生物等 , 正在通过碱基编辑技术开发通用型细胞疗法 , 理论上能够避免 CRISPR-Cas9 基因编辑导致的染色体异常 , 具有更好的安全性 。 论文链接:https://www.nature.com/articles/s41587-022-01377-0https://science.sciencemag.org/content/367/6481/eaba7365.abstract来源于公众号:生物世界
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