医学分子生物学试题答案( 三 ) _基因

空间特异性
基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity) 。在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity) 。
4.分子克隆：
(1)典型的基因重组（切，接，转，增，检）
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA 。
① DNA的体外重组（切、接）② 重组DNA分子的转化和筛选（转、增）③ 转化子的筛选和鉴定（检）
载体和目的基因的分离；载体和目的基因的切割；载体和目的基因的重组；重组DNA的转化和扩增；重组DNA的筛选和鉴定。
\"分\"是指分离制备合格的待操作的DNA ，包括作为运载体的DNA和欲重组的目的DNA（① 直接分离目的基因；② 通过化学合成法和PCR（聚合酶链式反应）扩增法（又称酶促合成法）获得基因；③ 通过构建cDNA文库或基因组文库，从中筛选目的基因）；\"切\"是指用序列特异的限制性核酸内切酶切割载体和目的基因；\"接\"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；\"转\"是指通过特殊的方法（原生质转化法、化学转化法、电穿孔转化法）将重组的DNA分子送入宿主细胞中，使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象， “增”进行复制和扩增；\"检\"则是从宿主群体中通过方法（抗生素抗性筛选、β-半乳糖苷酶插入失活型筛选、营养缺陷型筛选、原位杂交法筛选、Southern印迹法筛选、限制性酶切法筛选、蛋白质生物学功能法筛选、免疫沉淀法筛选、聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选）挑选出携带有重组DNA分子的个体。
(2)DNA分子体外连接技术
黏性末端DNA片段的连接
DNA连接酶能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。应用
DNA连接酶可在体外将具有黏性末端的DNA限制片段，插入到适当的载体分子上，从而可能按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子
平头末端DNA片段的连接
T4DNA连接酶法：可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。
同聚物加尾法：应用末端脱氧核苷酸转移酶，能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3’ -OH基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴。需用5’特异的核酸外切酶处理平末端的DNA分子上产生带5’ -OH的单链延伸。
化学合成的衔接物连接DNA分子：衔接物(1inker) ，是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成的，具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
(3)蓝白斑筛选原理
β-半乳糖苷酶插入失活型筛选
载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和筛选，当有外源基因插入该显色基因后，其显色反应消失。【蓝白筛选原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。】
（4）工具酶是什么？常用的工具酶有哪些？
工具酶（tool enzymes）：指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统。
【医学分子生物学试题答案】工具酶的种类:
①\u0001限制性核酸内切酶（restriction endonadease)【Ⅰ、Ⅲ型它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大。 Ⅱ型也就是基因工程说到的限制酶核酸内切酶， Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2+作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段。同裂酶:指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶:指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶】、② DNA连接酶（DNA ligase)【催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′-OH、5′-P连接作用。】、③逆转录酶(reverse transcriptase)[逆转录酶是一种多功能酶，它的酶活性有：逆转录酶：以mRNA为模板合成cDNA；DNA依赖DNApol：以ssDNA为模板， 3-OH DNA片段为引物，合成DNA链。 RnaseH：外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA杂交分子RNA链，有两种：①5′→3′外切RNA ，称5′→3′外切RNA酶；② 3′→5′外切RNA ，称3′→5′外切RNA酶，也称RnaseH 。

医学分子生物学试题答案( 三 )

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