图2 心脏成纤维细胞的细胞类型多样性
3. 心脏再生成纤维细胞的鉴定
为了集中分析那些可能是再生生态位一部分的成纤维细胞亚型 ， 作者分析了损伤后细胞簇的动力学 。 col11a1a、col12a1a和nppc特征表达的3簇成纤维细胞在再生高峰期短暂出现 (3、 7 d.p.i.) ， 但在受伤前和再生完成后几乎不存在 。 由于其短暂性 ， 作者将这三个基因簇称为细胞状态 ， 而不是细胞类型（图3a） 。 为了对鉴定的成纤维细胞进行空间分辨 ， 作者进行了荧光原位杂交证实了瞬时成纤维细胞状态在边界区以及损伤区的位置（图3b） 。 之后发现nrg1在col12a1a成纤维细胞中特别高的表达 ， 而fn1a几乎只在col11a1a成纤维细胞中表达（图3c） 。 作者推断瞬时细胞状态的潜在再生功能可能是由分泌因子驱动的 。 生物信息学分析显示 ， 与未损伤的对照组心脏相比 ， 再生心脏的分泌组基因表达在3 d.p.i.和7 d.p.i.时增加（图3d） 。 col11a1a和col12a1a成纤维细胞中分泌组基因的表达在所有检测到的细胞簇中最高 ， 且其分泌组基因包含在再生、形态发生和组织发育等方面具有功能的基因（图3e） 。
虽然作者对单细胞基因表达谱的时空分析强烈表明了瞬时成纤维细胞的再生功能 ， 但还需要额外的实验来验证这一假设 。 为了从功能上评估瞬时col11a1a和col12a1a成纤维细胞的作用 ， 作者使用硝基还原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系统进行靶向细胞剔除 。 在MTZ处理后的转基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中 ， 在7 d.p.i.时相较于对照 ， 5 / 6的心脏显示心肌细胞增殖减少 ， col12aa表达细胞减少（图3gh） 。 在30d.p.i.时 ， col12a1+细胞剔除显著损害心脏再生（图3ij） 。 总之 ， 作者确定了心脏再生过程中具有潜在再生作用的三种成纤维细胞状态:col11a1a、col12a1a和nppc成纤维细胞 。 基因细胞剔除数据强烈表明col12a1a表达细胞在再生生态位中发挥了作用 。
图3 心脏再生成纤维细胞的鉴定
4. 心外膜成纤维细胞的鉴定
接下来 ， 作者想要阐明短暂成纤维细胞状态的起源 ， 以便更好地理解它们的激活机制 。 于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技术的大规模平行谱系追踪方法LINNAEUS 。 这种方法将细胞通过可遗传的DNA条形码(遗传疤痕)标记 ， 它们由Cas9在早期发育过程中产生 ， 其独特的序列能够识别疤痕产生时来自同一亲本的细胞 。 通过对同一个单细胞的遗传疤痕和转录组进行测序 ， 作者便可以建立谱系树 ， 揭示这些细胞类型的共同发育起源（图4a） 。 在谱系树中 ， 一个节点中的所有细胞共享相同的发育祖先（比如图4a ， B和C节点就共享相同发育祖先A） ， 并且每个节点上不同瞬时细胞状态下的每个细胞均可在相同的上一节点中对应找到（比如在图4a的谱系图中节点C就包含了3种瞬时细胞状态 ， 这三种状态下的所有细胞均可以在上一节点的对应细胞状态中找到） 。 作者还计算了不同树节点中细胞类型比率之间的相关性 ， 以确定哪些细胞类型通过谱系相关联（图4b） 。 谱系相关性聚类热图显示 ， 在3 d.p.i.时有4簇细胞类型 ， 在7 d.p.i.时有7簇细胞类型 。 在这两个时间点 ， 所有的免疫细胞共享一个相同的谱系 。 此外 ， 几种成纤维细胞：col11a1a、col12a1a和构成型成纤维细胞 ， 它们和心外膜细胞聚集在一起 ， 这表明这些成纤维细胞与心外膜细胞具有共同的发育起源（图4cd） 。 为了验证这一结论 ， 作者又构建了转基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch) 。 重组后 ， 在7 d.p.i.表达的mCherry与内源性表达的col12a1a共定位（图4e） ， 证实了瞬时col11a1a和col12a1a成纤维细胞为心外膜或心外膜衍生成纤维细胞的起源 。 为了进一步阐明短暂心外膜成纤维细胞状态的起源 ， 作者应用了RNA速度分析方法 ， 对心外膜谱系簇中所有心室细胞类型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的发育轨迹进行推断（图4f） ， 得到了相同的结论 。
图4 心外膜成纤维细胞的鉴定
5. 心内膜成纤维细胞的鉴定
瞬时nppc成纤维细胞和其他几个成纤维细胞亚型(spock3、cfd和瓣膜成纤维细胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.时不属于心外膜谱系 ， 但与心内膜以及彼此之间显示中度正相关 。 基于相关性的分析有一个潜在的假设 ， 即所有克隆体都会表现出相似的转换率（图5a） ， 但是这种假设并不适用于所有细胞类型 ， 于是作者引入条件概率开发了第二种算法（图5b） 。 在3 d.p.i.时 ， 不同成纤维细胞类型：col11a1a成纤维细胞、构成型成纤维细胞、心外膜(心室)转变为col12a1a成纤维细胞类型的条件概率均大于0.9（图5c） 。 在7 d.p.i. 时 ， 不同的心内膜细胞类型：心内膜（心房）、心内膜（心室）和心内膜 ( frzb )转变为nppc成纤维细胞的条件概率均大于0.8 ， 表明这种成纤维细胞类型与心内膜之间存在谱系关系 。 为了验证算法的真实性 ， 作者构建了转基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch) 。 在7 d.p.i.表达的EGFP与内源性表达的nppc共定位（图5e） ， 证实了瞬时nppc成纤维细胞的心内膜起源 。 RNA速度分析揭示了心室内膜和nppc成纤维细胞之间的转录相似性和潜在的过渡路径（图5f） 。 从单细胞转录组数据中观察到 ， 与健康对照组心脏相比 ， 心内膜在7 d.p.i.时发生了激活反应（图5g） 。
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