图3.HeLa细胞中SIRT5触发的自组装 。 与（a）500μM肽2 ， （b）50μM肽2和（c）500μM肽2 + 300μMSIRT5抑制剂孵育后的不同时间点的HeLa细胞的荧光共聚焦显微镜图像 。
3.线粒体发生自组装
为了探索纳米纤维是否在线粒体区域内空间形成 ， 作者通过孵育肽2和MitoTracker Red（一种用于特异性标记线粒体的染料）进行了共定位实验 。 如图4a-c所示 ， 在包含NBD的纳米纤维的荧光图像和MitoTracker Red的荧光图像之间可以观察到实质性的重叠 ， 表明形成的纳米纤维确实位于线粒体区域 。 此外 ， 在细胞的其他区域如细胞核中未观察到明显的NBD荧光 。 线扫描图（图4d）还证明了肽2纳米纤维的荧光与MitoTracker Red的荧光重叠良好 。 这些数据强烈表明两种染料之间存在显着的共定位水平 ， 这证实假设 ， 即肽2被SIRT5脱琥珀酰化并主要在细胞的线粒体区域自组装 。 此外 ， 结合细胞分级分离和TEM成像实验来证明线粒体中纳米纤维的选择性形成 。 简而言之 ， 首先将HeLa细胞与肽2一起孵育 ， 然后通过文献中所述的方案分离细胞核 ， 线粒体和胞质溶胶级分 。 进一步的TEM可视化清楚地表明 ， 线粒体级分中存在纳米纤维 ， 而其他纤维中则没有 。 诸如细胞核和胞质溶胶（图4e） 。 纳米纤维的尺寸也与图2c所示一致 。 另外 ， 没有肽2孵育的对照细胞仅显示出无定形物质（图4f） 。 结合荧光和TEM成像实验 ， 这些数据有力地证明了可以用肽2在线粒体中选择性地形成超分子纳米结构 。
图4.共定位和细胞分离实验 。 用500μM肽2和100 nM MitoTracker Red孵育的HeLa细胞的荧光共聚焦显微镜图像；（a）MitoTracker Red通道；（b）NBD频道；（c）覆盖 。 比例尺= 20μm 。 （d）在（c）中横跨HeLa细胞的线性区域的线扫描图 。 （e）与肽2过夜孵育后的线粒体级分的TEM图像 。 （f）没有与肽2过夜孵育的线粒体级分的TEM图像 。
4.自组装改变线粒体活性并诱导ROS形成
为了检查由SIRT5介导的肽自组装是否可以调节线粒体活性 ， 作者进一步合成了没有荧光团的肽2类似物Fmoc-FFFGKsuccG（肽5 ， 图5a） 。 由于该肽不含荧光团 ， 因此不会干扰细胞成像实验所需的荧光测试 。
图5.（a）肽5的化学结构 。 （b）与SIRT5和NAD+在缓冲液中孵育的肽5的TEM图像 。 （c）用肽5孵育HeLa细胞后 ， 线粒体级分的TEM图像 。 比例尺= 200 nm 。 （d）暴露于500μM肽5 6 h的HeLa细胞中JC-1染色的荧光图像 。 比例尺= 50μm 。 （e）HeLa细胞中与500μM肽5孵育6 h的Mito-SOX染色的荧光图像 。 对照：在不使用肽5的情况下用载体处理的细胞 。 比例尺= 50μm 。 （f）定量分析（d）中红色荧光与绿色荧光的比率 ， P = 0.006 。
实验结果表明 ， SIRT5可以有效地将85％以上的肽5脱琥珀酰化 。 接下来 ， 通过水凝胶和TEM实验证实了具有SIRT5的肽5的体外自组装活性（图5b） 。 随后 ， 将HeLa细胞与肽5孵育过夜 ， 并分离线粒体级分 。 实际上 ， 在处理肽5后 ， 线粒体部分中发现了大量的纳米纤维（图5c） 。 另一方面 ， 在未添加肽5的对照细胞中未发现纳米纤维 。 此外 ， 通过ESI-MS分析在线粒体级分中发现了肽5的去琥珀酰化产物 ， 进一步证明了肽5可以被活细胞中的内源性SIRT5脱琥珀酰化 。 这些结果共同证明 ， 与肽2相似 ， 肽5可以被内源性SIRT5脱琥珀酰化并在线粒体中选择性地形成纳米纤维结构 。
5.肽的自组装增强了不同药物的抗癌活性
作者测试了肽5的细胞毒性（图6d） 。 孵育72小时后 ， 浓度为500μM的肽本身对HeLa细胞的细胞毒性较低 ， 表明该肽具有良好的生物相容性 。 令人欣慰的是 ， 将肽5与这三种药物共同温育可显着提高其对HeLa细胞的杀伤能力 。 例如 ， 将0.2 M DCA与肽5共孵育会导致90％以上的细胞死亡（图6a） 。 同样 ， 将低剂量的顺铂（0.4μM）与肽5一起使用会导致80％以上的细胞死亡（图6b） 。 2.5 nM紫杉醇与肽5的共孵育杀死了90％以上的细胞（图6c） 。
图6.用（a）DCA ， （b）顺铂 ， （c）含或不含500μM肽5的紫杉醇和（d）仅含肽5（0–500μM）孵育的HeLa细胞的细胞活力测定 。
全文参见：
doi.org/10.1021/jacs.0c08463
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