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1 背景介绍
微生物多样性是基于 Illumina 测序平台 ， 利用双末端测序（Paired-End）的方法 ，构建小片段文库进行测序 。 通过对 Reads 拼接过滤 ， 序列去噪或者OTUs（Operational Taxonomic Units）分组 ， 并进行物种注释及丰度分析 ， 可以揭示样品的物种构成； 进一步进行α多样性分析（Alpha Diversity）、β多样性分析（Beta Diversity）等等 ， 可以挖掘样品之间的差异 。
目前 ， 微生物多样性研究主要是于编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的 。 细菌主要是基于16S区 ， 真菌主要基于18S区或ITS区（内转录间区） ， 16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16S rRNA）的DNA序列 ， 18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA（18S rRNA）的DNA序列 ， ITS是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA内转录间隔区序列 。 这些序列中既有保守区又有可变区 ， 保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系 ， 而高变序列区域则能体现物种间的差异 。 由于18S rDNA在进化速率上比较保守 ， 在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类 。 常用作微生物分类研究的ITS分为ITS1和ITS2两种 。 ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列的18S和5.8S之间 ， ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间 。 由于ITS区在核糖体RNA加工过程中被剪切掉 ， 不发挥功能作用 ， 在进化过程中选择压力较小 ， 进化速率约为18S rDNA的10倍 ， 属于中度保守的区域 ， 利用它可研究种及种以下的分类阶元 。 另外 ， 也可通过选择引物同时扩增18S rDNA和ITS ， 通过分析18S rDNA序列 ， 先在较高级别上确定样品的归属 ， 然后根据ITS 序列 ， 将真菌归类到种或亚种水平 。
2 科沿有道实验流程
从DNA样本到最终数据获得的过程中 ， 样本检测、PCR、纯化、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响 ， 而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果 。 为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性 ， 样本检测、建库、测序每一个实验步骤都严格把控 ， 从根本上确保了高质量数据的产出 ， 流程图如下：
图1 实验流程图
2.1 基因组DNA的提取
采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取 ， 之后采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度 ， 取适量的样品于离心管中 ， 使用无菌水稀释样品至1ng/μl 。
2.2 PCR扩增
以稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择 ， 使用带Barcode的特异引物 。 使用高效和高保真的酶进行PCR ， 确保扩增效率和准确性 。 PCR反应体系及反应条件见下图：
图2 PCR反应体系及反应条件
2.3 PCR产物的混样和纯化
PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样 ， 充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 。
【微生物16S扩增子测序分析】2.4 文库构建和上机测序
构建好的文库经过Qubit定量和文库检测 ， 合格后 ， 使用Illumina平台进行测序 。 高通量测序（如Illumina 等测序平台）得到的原始图像数据文件 ， 经碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads） ， 结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储 ， 其中包含测序序列（Reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息 。
3 科沿有道信息分析流程
为了使信息分析的结果更加准确、可靠 ， 首先对原始数据进行拼接、过滤 ， 得到有效数据（Clean Data） 。 然后基于有效数据按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch的分析流程进行序列去噪或OTU聚类 ， 随后再进行物种分类分析 。 根据去噪或者聚类结果 ， 一方面对每个序列做物种注释 ， 得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况 。 同时 ， 对ASVs或OTUs进行丰度、Alpha多样性计算、Venn图等分析 ， 以得到样本内物种丰富度和均匀度信息、不同样本或分组间的共有和特有ASVs或OTUs信息等 。 另一方面 ， 可以对ASVs或OTUs进行多序列比对并构建系统发生树 ， 通过PCoA、PCA、NMDS等降维分析和样本聚类树展示 ， 可以探究不同样本或组别间群落结构的差异 。 为进一步挖掘分组样本间的群落结构差异 ， 选用STAMP、MetaStat、LEfSe、Anosim和MRPP等统计分析方法对分组样本的物种组成和群落结构进行差异显著性检验 。 扩增子的注释结果还可以利用PICRUST软件相应的功能数据库相关联 ， 对其KEGG、COG等数据库进行相关分析 。
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