免疫组化原理及流程介绍( 二 ) _抗体

2.包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3.切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为 5μm如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。
4.捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。
5.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min天气热可以少放几分钟相反天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间一般为12-15min.
6.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min ，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2 ，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min ，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900μlPBS：100μl血清封闭液）。
8.加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS 。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min ，擦干组织周围的PBS后加上二抗然后置于37°C温箱中半小时。
10.加SABC:将片子从温箱中取出放入PBS中洗3次，每次5min ，擦干组织周围的PBS后加上SABC 然后置于37°C温箱中半小时。 SABC稀释100倍（990μlPBS：10μlSABC）。
11.加显色剂：将片子从温箱中取出放入PBS中洗3次，每次5min ，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A ，摇匀，然后加1滴显色剂B ，摇匀，再加1滴显色剂C ，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
12.复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min 。
13.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min ，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
【免疫组化原理及流程介绍】14.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。

免疫组化原理及流程介绍( 二 )

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