1.优点
（1）可信度高：一般用细胞或者组织样本进行检测 ， 同物种且体内原始蛋白 ， 不会出现异源表达对蛋白的影响 ， 以及不会因为表达部位不同而导致假阳性的存在 ， 因此可信度高；
（2）周期短：若直接用组织或者细胞进行实验 ， 一周能出来结果；
2.缺点
（1）通量相对低：可以同时做1个蛋白和多个蛋白的互作验证；
（2）若用293T做检测 ， 或者进行改造载体转染293T细胞 ， 记性coip实验 ， 可以解决在体组织细胞难取的问题 ， 但是难点是周期长 ， 表达难度大 ， 需要进一步验证；
（3）IP技术相对难；
（4）最终检测手段WB比酶标仪麻烦一些；
3.实验步骤
（1）总蛋白提取：样本中加入蛋白提取液200uL；上蛋白质能研磨仪 ， 低温研磨2min；4℃12000rpm ， 离心15min收集上清 ， 上清BCA蛋白定量法测定蛋白浓度为9.825mg/ml ， 约180uL 。
（2）取10uL全蛋白 ， 作为input以备Western blot分析 ， 剩余样本加入1μg相应的抗体 ， 4℃摇床孵育过夜；
（3）取10μL protein A 琼脂糖珠 ， 用适量裂解缓冲液洗3 次 ， 每次3000 rpm离心3min；
（4）将预处理过的10μL protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的蛋白提取物中4℃摇床孵育2-4h ， 使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；
（5）免疫沉淀反应后 ， 在4℃以3000 rpm 离心3 min ， 将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去 ， 琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μL的2×SDS 上样缓冲液 ， 沸水煮5min；
（6）SDS-PAGE Western blotting分析确定相互作用蛋白 。
4.实验结果
实验结论：A和B蛋白、B和C蛋白、A和C蛋白互作；
三、Pull Down检测方法
下拉实验（pull-down assay）是验证体外蛋白互作的主要方式 ， 也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一 。 通过体外表达亲和蛋白-GST ， 将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白” ， 将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白” ， 最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测 ， 就可以分析蛋白和蛋白互作关系 。
1.优点
（1）无法进行体内互作检测的可以进行此项目；
（2）当无法获得在体样本或者在体样本没有特异性一抗可以使用但是又必须进一步验证蛋白互作结论时 ， 用到了pull down实验；
2.缺点
（1)周期长 ， 价格贵：主要是需要构建蛋白表达载体 ， 蛋白纯化后才能做实验；很多时候蛋白不一定能表达出来 ， 载体也需要多次尝试；
(2)结果可靠性：高于双荧光素酶 ， 低于coip实验 ， 体外将2个蛋白放一起 ， 排除了其他的干扰；
3.实验步骤
3.1载体构建
常规使用标签：GST、HIS、MBP等 ， 对应这些标签的载体很多 ， 常规是PET系列（28a等）和PGEX载体系列（4T1等）；不同的蛋白在载体上表达效果不同 ， 也有可能表达在包涵体中 ， 导致无法纯化 ， 其中有时候需要对载体进行改造促使蛋白促溶 ， 均需要载体构建进行尝试；
3.2蛋白表达预实验
(1)将构建好的载体转入BL21菌株中 ， 通过PCR检测确定转化成功；
(2)将BL21细菌扩大培养 ， 至OD=0.6-0.8时 ， 加入IPTG；
(3)设置IPTG浓度 ， 诱导时长以及诱导温度（浓度可以时0.3、0.5、0.7等 ， 时长可以暂定16h或者12h等；温度可以时28℃或者16摄氏度等都可以）
(4)转速也会影响蛋白表达情况 ， 可以暂定一个转速 ， 到时间后 ， 离心 ， 收集菌体；
(5)加入PBS缓冲液 ， 重选细菌 ， 放入超声破碎仪中进行超声破碎；
(6)破碎后 ， 4℃ ， 离心 ， 收集上清；
(7)上清加入Loadnig buffer变性 ， 煮10min；
(8)Western blot检测表达效果；
3.3蛋白大量表达纯化鉴定
(1)通过上述预实验 ， 选择合适的IPTG诱导浓度 ， 诱导时间以及诱导温度 ， 进行大量培养；
(2)收集全部上清 ， 若使用GST标签蛋白 ， 可以按GST成品纯化柱进行纯化浓度；
(3)考马斯亮蓝染色：取2ug GST-A HIS-B加适量SDS-loading buffer ， 100度煮10min ， 上样进行蛋白电泳 。
(4)电泳结束后 ， 切胶 ， 加入考马斯亮蓝染色液 ， 过夜染色 。
(5)用脱色液进行脱色至无背景 。
3.4 Pull Down
（1）安装柱子 ， 用PBS平衡柱子（加入使其自然流下）
（2）加入2 mL GST-A到一个封闭的GST柱子4℃ rotate混匀6 h 。
（3）将孵育液流出后（收F1） ， 用已预冷的300 mL 1×PBS洗涤GST柱子约20次（6ml加入后上下盖子盖好颠倒混匀 ， 打开流出） ， 4℃；（流出的PBS要收集 ， 洗涤液收集3管 ， 刚开始 ， 中间 ， 最后 ， 标为W1W2W3）
推荐阅读
- 钻世界上最深的洞如何给我们带来无限的绿色能源
- 人类是被困在太阳系的囚徒？太阳系边缘发现50000度火墙，危险？
- 生物医药领域常用的蛋白变性剂有哪些呢？
- 航天员回来后，能得到哪些奖励？每年都设立600万元大奖!
- 世界十大死亡禁地之圣路易斯谷，外星人在地球的接头点？
- 神舟十四号三位航天员成功返回出舱！飞船侧面为何出现个大窟窿？
- 吞噬星空，洪也拥有蓝银草 生命体征消失，地球最强者陨了......
- 我们能前往未来，但为什么不能回到过去？
- 哪怕外星人入侵，也挡不住人们做核酸的脚步