
文章图片

文章图片

文章图片

文章图片

生物通过体内各种反应机制响应外界刺激(例如病毒、电击、细菌等) , 从而使机体顺利运转 。 在这个响应中 , DNA、RNA、蛋白、代谢物等等都会参与其中 。 由于大部分的功能传递发挥在蛋白水平 , 因此大家也更关注蛋白的调控机制 , 包括蛋白表达水平、蛋白磷酸化、乙酰化、蛋白互作等 , 本次讲述的蛋白和蛋白的互作从而传递信号到下游 , 也是其中一种机制 。
蛋白是由DNA通过转录形成RNA , 通过翻译得到一系列氨基酸组成的一个具有空间结构的物质 , 当2个蛋白质在空间上能够结合在一起 , 从而隐藏某些氨基酸位点、或者使下一个氨基酸发生磷酸化、或者表达能够激活等 , 都是可以传递信号调控机体反应的 。 那么如何验证2个蛋白使互作的呢 , 方法有多种 , 各有优缺点 , 这里小编给大家介绍一下 。
一、NanoBiT检测方法
NanoLuc? Binary Technology (NanoBiT?) 是一种基于最新专利萤光素酶 NanoLuc?萤光素酶的二亚单元系统 , 用来检测活细胞内蛋白质的相互作用 。 系统将萤光素酶-NanoLuc?Luciferase 分为两个亚基 , 即大 BiT (LgBiT;18 kDa) 和小 BiT (SmBiT;11 氨基酸肽 ) , 这2个亚基可与 2 个待测目的蛋白分别表达为融合蛋白 , 当目的蛋白之间的相互作用使两个亚基结合时 , 从而得到有活性的萤光素酶 , 进而可与底物反应产生发光 。
1.优点:
(1)周期快:载体构建好以后直接转化293T细胞48h后即可检测;
(2)检测方法简单:添加底物以后直接酶标仪即可快速检测;
(3)高通量筛选:每一种蛋白均需要构建载体 , 但是转染后酶标仪可以同时检测384孔;
(4)活细胞检测:蛋白在活细胞内进行互作检测;
2.缺点:
(1)一般是进行293T细胞检测 , 存在不同物种不表达系统 , 有可能调控机制不同;
(2)强行将2个蛋白表达在同一空间 , 实际在动物体内是否互作还需要验证;
3.实验步骤
2.1 载体构建并测序:A-SmBiT、B-LgBiT;
2.2 细胞复苏:
293T细胞培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S 。
(1)将细胞从液氮中取出 , 快速放入37°C水浴锅中 , 轻摇冻存管使冻存液溶解;
(2)溶解后离心收集细胞 , 弃上清 , 用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞 ,37℃、5% CO2培养;
(3)细胞的密度达到80%时 , 对细胞进行传代扩大培养:
(4)取处于对数生长期 , 生长状态良好的细胞 , 以1×104个/孔接种于细胞培养96孔板 , 37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;
(5)转染前2小时 , 换成无血清DMEM培养基;
(6)转染步骤:
对于每个转染样品 , 均按下面的方法准备:
a用5μl无血清opti-MEM稀释混合质粒(A-SmBiT , B-LgBiT , EGFP) , 室温下静置5分钟;
b取0.2μl的LipofectamineTM 2000稀释在5μl opti-MEM中 , 室温下静置5分钟;
c混合LipofectamineTM 2000和质粒的稀释液(总体积为10μl) , 轻轻混匀并在室温下静置20分钟;
d每个培养孔分别加混合液10μl , 细胞培养6h后吸出混合液换入正常培养基;
e37℃、5%CO2培养箱中培养48h后 , 检测EGFP荧光值以及luc化学发光值;
转染分组:
(1)SmBiT空载 + LgBiT空载 + EGFP质粒
(2)A-SmBiT空载 + B-LgBiT + EGFP质粒
4.实验结果案例
转染后GFP荧光拍照
实验结论:GFP为内参荧光 , 有互作的蛋白就会产生LUC检测值 , 若没有互作 , 则LUC检测值很低;因此判断A和B蛋白互作 。
二、CoIP检测方法
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)也成为Co-IP当2个蛋白发生互作时 , 可以通过其中一个蛋白结合某种介质(磁珠)进行沉淀富集 , 把与它互作的所有蛋白都可以一起沉淀下来 , 因此可以对沉淀后的样本进行蛋白检测 , 就可以确定蛋白之间的互作关系;因此此技术称为免疫共沉淀 。
推荐阅读
- 钻世界上最深的洞如何给我们带来无限的绿色能源
- 人类是被困在太阳系的囚徒?太阳系边缘发现50000度火墙,危险?
- 生物医药领域常用的蛋白变性剂有哪些呢?
- 航天员回来后,能得到哪些奖励?每年都设立600万元大奖!
- 世界十大死亡禁地之圣路易斯谷,外星人在地球的接头点?
- 神舟十四号三位航天员成功返回出舱!飞船侧面为何出现个大窟窿?
- 吞噬星空,洪也拥有蓝银草 生命体征消失,地球最强者陨了......
- 我们能前往未来,但为什么不能回到过去?
- 哪怕外星人入侵,也挡不住人们做核酸的脚步