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生物通过体内各种反应机制响应外界刺激（例如病毒、电击、细菌等） ， 从而使机体顺利运转 。 在这个响应中 ， DNA、RNA、蛋白、代谢物等等都会参与其中 。 由于大部分的功能传递发挥在蛋白水平 ， 因此大家也更关注蛋白的调控机制 ， 包括蛋白表达水平、蛋白磷酸化、乙酰化、蛋白互作等 ， 本次讲述的蛋白和蛋白的互作从而传递信号到下游 ， 也是其中一种机制 。
蛋白是由DNA通过转录形成RNA ， 通过翻译得到一系列氨基酸组成的一个具有空间结构的物质 ， 当2个蛋白质在空间上能够结合在一起 ， 从而隐藏某些氨基酸位点、或者使下一个氨基酸发生磷酸化、或者表达能够激活等 ， 都是可以传递信号调控机体反应的 。 那么如何验证2个蛋白使互作的呢 ， 方法有多种 ， 各有优缺点 ， 这里小编给大家介绍一下 。
一、NanoBiT检测方法
NanoLuc? Binary Technology (NanoBiT?) 是一种基于最新专利萤光素酶 NanoLuc?萤光素酶的二亚单元系统 ， 用来检测活细胞内蛋白质的相互作用 。 系统将萤光素酶-NanoLuc?Luciferase 分为两个亚基 ， 即大 BiT (LgBiT；18 kDa) 和小 BiT (SmBiT；11 氨基酸肽 ) ， 这2个亚基可与 2 个待测目的蛋白分别表达为融合蛋白 ， 当目的蛋白之间的相互作用使两个亚基结合时 ， 从而得到有活性的萤光素酶 ， 进而可与底物反应产生发光 。
1.优点：
（1)周期快：载体构建好以后直接转化293T细胞48h后即可检测；
（2）检测方法简单：添加底物以后直接酶标仪即可快速检测；
（3）高通量筛选：每一种蛋白均需要构建载体 ， 但是转染后酶标仪可以同时检测384孔；
（4）活细胞检测：蛋白在活细胞内进行互作检测；
2.缺点：
（1）一般是进行293T细胞检测 ， 存在不同物种不表达系统 ， 有可能调控机制不同；
（2）强行将2个蛋白表达在同一空间 ， 实际在动物体内是否互作还需要验证；
3.实验步骤
2.1 载体构建并测序：A-SmBiT、B-LgBiT；
2.2 细胞复苏：
293T细胞培养基：DMEM+10%FBS+1%P/S 。
（1）将细胞从液氮中取出 ， 快速放入37°C水浴锅中 ， 轻摇冻存管使冻存液溶解；
（2）溶解后离心收集细胞 ， 弃上清 ， 用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞 ，37℃、5% CO2培养；
（3）细胞的密度达到80%时 ， 对细胞进行传代扩大培养：
（4）取处于对数生长期 ， 生长状态良好的细胞 ， 以1×104个/孔接种于细胞培养96孔板 ， 37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；
（5）转染前2小时 ， 换成无血清DMEM培养基；
（6）转染步骤：
对于每个转染样品 ， 均按下面的方法准备：
a用5μl无血清opti-MEM稀释混合质粒(A-SmBiT ， B-LgBiT ， EGFP) ， 室温下静置5分钟；
b取0.2μl的LipofectamineTM 2000稀释在5μl opti-MEM中 ， 室温下静置5分钟；
c混合LipofectamineTM 2000和质粒的稀释液（总体积为10μl） ， 轻轻混匀并在室温下静置20分钟；
d每个培养孔分别加混合液10μl ， 细胞培养6h后吸出混合液换入正常培养基；
e37℃、5％CO2培养箱中培养48h后 ， 检测EGFP荧光值以及luc化学发光值；
转染分组：
（1）SmBiT空载 + LgBiT空载 + EGFP质粒
（2）A-SmBiT空载 + B-LgBiT + EGFP质粒
4.实验结果案例
转染后GFP荧光拍照
实验结论：GFP为内参荧光 ， 有互作的蛋白就会产生LUC检测值 ， 若没有互作 ， 则LUC检测值很低；因此判断A和B蛋白互作 。
二、CoIP检测方法
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）也成为Co-IP当2个蛋白发生互作时 ， 可以通过其中一个蛋白结合某种介质（磁珠）进行沉淀富集 ， 把与它互作的所有蛋白都可以一起沉淀下来 ， 因此可以对沉淀后的样本进行蛋白检测 ， 就可以确定蛋白之间的互作关系；因此此技术称为免疫共沉淀 。
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