方案一
GOX-on-Fe-iCOF（GFeF）纳米酶及其通过级联反应形成的水凝胶形式的制备和体内抗菌应用的示意图 。
2结果与讨论
2.1 GFeF纳米酶的制备与表征
图1
iCOF纳米颗粒的结构表征及其Fe离子螯合形式 。 A-C) iCOF、Fe-iCOF和GFeF分别在Fe离子螯合和GOX负载后的TEM图像 。 D)以相应颜色显示的Fe-iCOF的C、N、O、Fe和Br的EDS元素图 。 E)分散在水中的iCOF、Fe-iCOF和GFeF的紫外-可见光谱 。 F) iCOF的固体13C-NMR谱 。 G) Fe-iCOF中Fe 2p的高分辨率XPS光谱 。
图2
A) GFeF纳米酶对ABTS检测催化转化为ABTS自由基的级联反应示意图 。 B)含有ABTS的溶液在734 nm处的UV-vis吸收强度和1) PBS 2)葡萄糖 3)葡萄糖+ Fe-iCOF 4) GFeF 5)葡萄糖+ GOX 6)葡萄糖+ Fe-iCOF + GOX 和7)葡萄糖+ GFeF ， 分别 。 C、D) ABTS和GFeF纳米酶溶液的紫外-可见光谱 ， 它们在734 nm处的定量 ， 以及在添加不同浓度的葡萄糖后它们的颜色变化（插图） 。 E) ABTS溶液在4或37°C下存在GFeF和20 mM葡萄糖时在734 nm处的UV-vis吸收强度 。 F）在不同pH值下 ， 在GFeF和50 mM葡萄糖存在下ABTS溶液的紫外-可见光谱 。
在平行实验中 ， GFeF的葡萄糖触发级联反应通过使用相同的ABTS氧化测定进行测试 。 葡萄糖+ GFeF组获得最佳性能也就不足为奇了 。 在其他对照（PBS、葡萄糖、葡萄糖+ Fe-iCOF、GFeF、葡萄糖+ GOX和葡萄糖+ Fe-iCOF + GOX）中几乎没有观察到734 nm处的明显紫外线吸收（图S10 ， 支持信息） 。 与Fe-iCOF和GOX的简单混合物相比 ， GFeF实验组的紫外吸光度增加了三倍以上（图2B ， 支持信息） 。 将葡萄糖添加到GFeF和ABTS或TMB的混合物中会产生依赖于葡萄糖的行为 ， 正如更深的绿色所证实的那样（图2C、D和图S11 ， 支持信息） 。 在葡萄糖和ABTS指示剂混合物中增加GFeF浓度的情况下 ， 也可以发现类似的行为（图S12 ， 支持信息） 。 为了进一步探索纳米酶的反应动力学 ， 将不同浓度的H2O2或葡萄糖添加到Fe-iCOF (100 μg mL-1)或GFeF (100 μg mL-1)中 ， 通过监测ABTS的UV变化来监测生成的自由基分别为间隔时间的指标 。 在734 nm处观察到的ABTS的紫外吸光度显示了Fe-iCOF和GFeF样品中的底物浓度依赖性行为（图S13和S14 ， 支持信息） 。 Fe-iCOF和GFeF的计算米氏常数(Km)值分别为3.35和20 mM 。
2.3 GFeF纳米酶的体外抗菌活性
在活细胞和细菌中进一步研究了Fe-iCOF纳米酶的催化效率 。 首先 ， 通过CLSM图像研究了Fe-iCOF纳米粒子在小鼠成纤维细胞(L929)中的有效内化 ， 揭示了时间依赖性内吞作用 ， 从0.5到4小时的孵育时间增加了红色荧光（图S16 ， 支持信息） 。 此外 ， 无荧光DCFH-DA探针用于研究Fe-iCOF在模拟伤口感染和H2O2诱导的炎症下的模拟酶活性 。 与PBS、H2O2和Fe-iCOF处理相比 ， 用H2O2 + Fe-iCOF孵育的细胞显示出更亮的绿色荧光（图S17 ， 支持信息） ， 证实了将H2O2转移到?OH的高催化效率 。
同样 ， DCFH-DA探针在细菌水平上也证实了由葡萄糖触发的GFeF的高催化效率以产生更多的?OH（图S18 ， 支持信息） 。 分别采用平板计数法评价GFeF对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌活性 。 与PBS、Fe-iCOF、GFeF、葡萄糖和葡萄糖+ Fe-iCOF相比 ， 葡萄糖+ GFeF处理的抗菌活性最高 ， 如平板照片和大肠杆菌和S菌落计数所示 。 金黄色葡萄球菌（图3A-D） 。 我们接下来测试了600 nm (OD600)处的光密度 ， 以评估各种处理后的细菌浓度（图S19 ， 支持信息） 。 与其他对照组相比 ， 葡萄糖+ GFeF组在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的OD600值更小 ， 这归因于其通过级联反应产生更多?OH自由基的能力更强 。 此外 ， 这种葡萄糖触发的级联反应即使在低于5.5 mM的正常人体血糖浓度下也能很好地发挥作用（图S20 ， 支持信息） 。 为了表明这些优异抗菌剂的可能机制 ， 我们记录了含有或不含葡萄糖的扫描电子显微镜(SEM)图像 ， 以深入研究细菌的形态变化以及GFeF与细菌膜之间可能的相互作用 。 如图3E、F所示 ， 未经处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌仍保持原来的圆形和杆状 ， 这表明单独使用葡萄糖或GFeF对细菌的毒性几乎没有 。 然而 ， 经过葡萄糖和GFeF处理后 ， 细菌形态将发生变形 。 值得注意的是 ， 在SEM图像中观察到Fe-iCOF和GFeF与细菌的明显粘附（图3E、F） 。 阳性GFeF可以吸附在两种受试细菌的外表面 ， 缩短原位形成的?OH自由基与细菌之间的扩散距离 ， 从而有效杀灭细菌 。
图3
A)大肠杆菌和C)金黄色葡萄球菌在PBS、Fe-iCOF、GFeF、葡萄糖、葡萄糖+ Fe-iCOF和葡萄糖+ GFeF处理后形成的细菌菌落的照片 。 B)大肠杆菌和D)金黄色葡萄球菌菌落与1) PBS、2) Fe-iCOF、3) GFeF、4) 15 mM葡萄糖、5) 15 mM葡萄糖+ Fe-iCOF共孵育后的统计直方图 ， 和6) 15 mM葡萄糖+ GFeF 。 E)大肠杆菌和F)金黄色葡萄球菌在PBS、Fe-iCOF、GFeF、葡萄糖、葡萄糖+ Fe-iCOF和葡萄糖+ GFeF处理后的SEM图像 。
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