shRNA|『维真生物_RNA干扰』如何实现组织特异性干扰？

2021-09-13 效果 知识科普 组织生物检测水平基因干扰调控骨架 Mir shRNA miR30 miRNA 反子

基于mir30的shRNA
RNAi实验中shRNA的持续性表达常借助于聚合酶III型启动子，包括U6和H1 ，这类启动子虽然可以调控shRNA的高水平表达实现基因沉默，但由于缺少组织特异性，无法满足我们对特定组织中的基因表达进行调控的需求，这可如何是好？别忘了， shRNA具有与miRNA相似的成熟机制哦，因此可以用miRNA的骨架（目前常用的miRNA骨架有miR-30等）来表达，由聚合酶II型启动子（包括多种组织特异性启动子）驱动，实现RNA干扰的组织特异性表达！
shRNA和miRNA的细胞加工机制如下：

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（Lambeth L S , Smith C A . Humana Press, 2013.）
基于miR30骨架的shRNA具体设计方案：
选择合适的启动子，将miR30的5'flanking region和3'flanking region序列保留，然后将其成熟区域的序列替换成靶点序列。结构示意图如下：

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基于miR30骨架的shRNA有哪些优势呢？
①启动子选择性多：基于miR30的shRNA可以通过多种RNA聚合酶II启动子转录，可以使用组织特异性或诱导型启动子。

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②实现多个shRNA共表达：由于RNA聚合酶II可以启动较大的基因转录，因此多个shRNAmiR可以作为多顺反子由单个启动子驱动表达。
③可与报告基因ORF共表达：报告基因ORF与shRNAmiRs作为多顺反子一起共表达，有助于监测shRNA的转录。
知识扩展：如何检测或验证RNAi效果？
RNAi效果可从mRNA和蛋白质两个水平来进行量化。
①mRNA水平可以通过Northern Blot和实时定量PCR两种常用方法进行检测。
②蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。
在确认敲低效果时要考虑以下几个方面：
?目的基因在mRNA与蛋白水平上是否都有降低；
?shRNA/siRNA 是否有细胞毒性；
?降低shRNA/siRNA的量之后，是否仍然可以看到敲低效果；
【shRNA|『维真生物_RNA干扰』如何实现组织特异性干扰？】?多个shRNA/siRNA 是否可以得到同样的表型；

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