shRNA|『维真生物_RNA干扰』如何实现组织特异性干扰?

基于mir30的shRNA
RNAi实验中shRNA的持续性表达常借助于聚合酶III型启动子 , 包括U6和H1 , 这类启动子虽然可以调控shRNA的高水平表达实现基因沉默 , 但由于缺少组织特异性 , 无法满足我们对特定组织中的基因表达进行调控的需求 , 这可如何是好?别忘了 , shRNA具有与miRNA相似的成熟机制哦 , 因此可以用miRNA的骨架(目前常用的miRNA骨架有miR-30等)来表达 , 由聚合酶II型启动子(包括多种组织特异性启动子)驱动 , 实现RNA干扰的组织特异性表达!
shRNA和miRNA的细胞加工机制如下:

shRNA|『维真生物_RNA干扰』如何实现组织特异性干扰?
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(Lambeth L S , Smith C A . Humana Press, 2013.)
基于miR30骨架的shRNA具体设计方案:
选择合适的启动子 , 将miR30的5'flanking region和3'flanking region序列保留 , 然后将其成熟区域的序列替换成靶点序列 。 结构示意图如下:

shRNA|『维真生物_RNA干扰』如何实现组织特异性干扰?
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基于miR30骨架的shRNA有哪些优势呢?
①启动子选择性多:基于miR30的shRNA可以通过多种RNA聚合酶II启动子转录 , 可以使用组织特异性或诱导型启动子 。

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②实现多个shRNA共表达:由于RNA聚合酶II可以启动较大的基因转录 , 因此多个shRNAmiR可以作为多顺反子由单个启动子驱动表达 。
③可与报告基因ORF共表达:报告基因ORF与shRNAmiRs作为多顺反子一起共表达 , 有助于监测shRNA的转录 。
知识扩展:如何检测或验证RNAi效果?
RNAi效果可从mRNA和蛋白质两个水平来进行量化 。
①mRNA水平可以通过Northern Blot和实时定量PCR两种常用方法进行检测 。
②蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测 。
在确认敲低效果时要考虑以下几个方面:
?目的基因在mRNA与蛋白水平上是否都有降低;
?shRNA/siRNA 是否有细胞毒性;
?降低shRNA/siRNA的量之后 , 是否仍然可以看到敲低效果;
【shRNA|『维真生物_RNA干扰』如何实现组织特异性干扰?】?多个shRNA/siRNA 是否可以得到同样的表型;

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