AbMole科研-EV71利用小细胞外囊泡穿过血脑屏障通过胞吞感染中枢神经系统
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AbMole精研抑制剂十年 ， 最新的科研动态不断与您分享 。 本期与您分享的是: 肠病毒-71利用小细胞外囊泡穿过血脑屏障 ， 通过胞吞感染中枢神经系统 。
背景:肠病毒71型(EV71)引起的中枢神经系统(CNS)感染对儿童构成严重威胁 ， 部分患者可引起严重的神经源性并发症甚至死亡 。 然而 ， EV71感染中枢神经系统的发病机制尚不清楚 。
方法:采用脑微血管内皮细胞(BMECs)和星形胶质细胞共培养的方法构建体外血脑屏障(BBB)模型 ， 模拟中枢神经系统感染 。 通过密度梯度离心法从细胞培养上清中分离出EV71感染细胞(EV71‐sEVs)中的EV71病毒粒子和胞外小泡(sEVs) 。 血脑屏障模型分别用EV71病毒粒子和EV71‐sEVs感染 。 通过抑制不同的内吞方式确定了血脑屏障的交叉机制 。 为了验证体外实验结果 ， 建立了小鼠EV71感染模型 。 结果:含有病毒成分的EV71‐sEVs被BMECs内吞并释放到血脑屏障模型的外腔侧 ， 在感染早期不破坏血脑屏障的情况下感染星形胶质细胞 。 在感染后期 ， 通过下调PI3K/Akt信号通路 ， BMECs之间紧密连接(TJs)的完整性被破坏 。 结论:EV71利用循环的sEVs通过血脑屏障感染中枢神经系统 。
Amiloride (Abmole ， M3386 ， 纯度> 98%)是一种吡嗪化合物 ， 通过抑制肾小管上皮细胞的钠离子通道 ， 而抑制钠的重吸收 。 Dynasore (Abmole ， M2569 ， 纯度> 99%)是一种可渗透细胞的 ， 可逆的 ， 非竞争性的dynamin（发动蛋白）抑制剂 ， 抑制dynamin 1/2的GTPase活性 ， IC50为15 μM ， 也抑制线粒体dynamin Drp1 ， 对其他小GTP酶没有作用效果 。 Chlorpromazine (Abmole ， M20535 ， 纯度>99%)是一种典型的低效抗精神病药 ， 用于治疗精神分裂症等精神障碍 。 Nystatin (Abmole ， M3290 ， 纯度>4400u/mg)是一种多烯类抗真菌剂 ， 对许多霉菌和酵母菌是敏感的 ， 包括Candida spp 。
FIGURE 3. EV71‐sEVs crossed the brain endothelium via micropinocytosis.
由于sEVs介导的内吞作用是一种典型的跨细胞途径 ， 我们推测EV71可能利用sEVs作为与BMECs结合后通过内吞作用穿过血脑屏障的载体 。 用内吞抑制剂Dynasore预处理BMECs ， 可显著减少sEVs的摄取 ， 但对EV71病毒粒子无影响(图3AB) 。 Dynasore对EV71‐sEVs和Mock‐sEVs具有相同的抑制作用(图3CD) 。 这些结果表明 ， sEVs能够通过内吞作用通过脑内皮 ， 而病毒粒子不能通过脑内皮 。 为了确定sEVs内吞作用的具体机制 ， 将BMECs分别用转铁蛋白(网格蛋白依赖性内吞作用的标记物)和70 kDa的葡聚糖(大胞饮作用的标记物)和用DiD荧光染料标记的EV71‐sEVs处理 。 荧光显微镜分析显示EV71‐sEVs部分与小腔蛋白1、转铁蛋白和70 kDa的葡聚糖共定位 ， 表明EV71‐sEVs进入BMECs的胞吞是由小腔蛋白依赖性内吞、网格蛋白依赖性内吞和大胞细胞介导的(图3E) 。
为了确定对EV71‐sEVs的胞吞作用最重要的途径 ， 用不同内吞途径的抑制剂预处理BMECs ， 随后用流式细胞术检测DiD标记的EV71‐sEVs的摄取 。 当然 ， CCK8检测显示 ， 这些抑制剂的浓度对BMECs没有细胞毒性(图3F) 。 Chlorpromazine (一种网格蛋白依赖性内吞作用的抑制剂)、Amiloride (一种大胞饮作用的抑制剂)和Nystatin (一种小腔蛋白依赖性内吞作用的抑制剂)都能减少EV71‐sEVs的摄取 。 显然 ， 使用阿米洛利治疗后 ， EV71‐sEVs的吸收明显减少(图3G) 。 总之 ， 结果表明 ， EV71‐sEVs通过脑内皮的主要途径是大型胞饮作用 。
【AbMole科研-EV71利用小细胞外囊泡穿过血脑屏障通过胞吞感染中枢神经系统】鸣谢：Jiaqi Gu et al. J Med Virol. 2022 Sep 2.
