单链|腺病毒包装(AAV)包装常见问题解答( 二 )


Q4:如何通过AAV实现体内的特异性表达?
由于目的基因在不同组织中功能不同 , 以及同一组织的不同细胞中功能也可能不同 , 所以我们实验过程中经常需要进行特异性表达 。 AAV可通过以下几种方式实现体内的特异性表达:
1. 组织特异性血清型 。 不同血清型的AAV具有不同的组织嗜性 , 因此首先要选择对特定组织感染能力强的血清型AAV 。
2.(细胞)特异性启动子 。 血清型主要利用侵染特异性 , 而启动子则是利用表达特异性 , 如某种特异性启动子AAV2 , 可侵染多种组织 , 但仅在某特定细胞表达 。
3. 局部注射 。 此外还可采用Cre依赖性基因开关(Cre-loxp系统) , 如用特异性启动子含cre酶的AAV注射Loxp小鼠实现特定组织或细胞目的基因的敲除 。
Q5:AAV作为一种体内常用的工具病毒 , 可实现什么功能?
1. 基因过表达 。 将目的基因的CDS区构建到AAV载体 , 注射到动物体内实现过表达 。
2. 基因干扰表达 。 将针对目的基因设计的shRNA构建到AAV载体 , 注射到动物体内实现干扰表达 。
3. 目的基因的敲除 。 将针对目的基因设计的gRNA和Cas9编码序列分别构建到AAV中 , 注射到动物体内实现基因敲除 。
【单链|腺病毒包装(AAV)包装常见问题解答】4. 内源过表达 。 将针对目的基因设计的gRNA和dCas9分别构建到AAV载体 , 实现内源过表达 。
Q6:AAV感染后荧光弱?
荧光弱主要有2方面的原因 , 一是组织感染的效率较差 , 另外就是检测的正确性 。 对于提高感染效率 , 则从病毒血清型是否合适、病毒使用量是否够、滴度是否合适 , 注射方法是否合理等方面进行分析;而对于检测 , 在组织样本切片制备的过程中 , 应考虑荧光蛋白的稳定性 , 如GFP遇酸容易淬灭等因素 , 从而确保检测的有效性 。
另外 , AAV病毒使用前需确认是否出现因储存不当而导致滴度下降的情况 。
Q7:AAV感染后过表达效果弱?
1. 病毒量不够:应充分调研高分文献报道 , 确定AAV滴度及用量 , 对于找不到参考文献的 , 也欢迎咨询我们 。
2. 载体表达效率低:更换启动子或增加强调控元件 。
3. 细胞负反馈机制:少数基因受上下游严格调控 , 这种情况较难实现过表达 。
4. 基因序列本身的元件:例如GC含量、隐蔽性剪接位点、转录终止信号和核酸二级结构等 , 也可影响表达 。 因此 , 密码子优化广泛用于增强AAV中目的基因表达 。
Q8:AAV的表达效果能维持多久?
AAV在细胞内主要是以环状的dsDNA附加体(circularised dsDNA episomes)的形式存在 , 而不会像慢病毒LV那样整合到宿主细胞的基因组 。 对于分裂不旺盛的细胞 , 如神经元 , AAV可持续表达1年以上甚至2年 , 对于分裂较旺盛的细胞 , 一般也可维持3~6个月或以上 。

推荐阅读