一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理( 二 )

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▲ Gibco? Dynabeads磁珠 02
【一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理】细胞改造
实现CAR在T细胞上的表达，是CAR-T生产的核心技术，这一步需要利用到载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。目前有多种方法用于T细胞修饰，包括病毒载体转导（如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等）及非病毒载体转染（转座子转染、电穿孔等技术等）。已上市的5款CAR-T产品以病毒载体转导的方式为主，吉利德旗下Kite的Yescarta和Tecartus采用了γ-逆转录病毒载体，其它3款基于慢病毒载体开发，分别是诺华的Kymriah、Juno的Breyanzi ，以及百时美施贵宝/bluebird bio的Abecma 。2.1慢病毒慢病毒（LV）载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而实现目的序列的持久性表达。相比于其它病毒载体，使用LV载体的优势包括其可携带相对较大的负载，且遗传元件仅在整合后才有活性；因此，可相对简单地达到所需的滴度以及获得单个整合元件。用于将CAR转导进T细胞的LV载体，是CAR-T细胞生产过程中的关键原材料。 LV规模化生产的产能、成本、质量等各方面都将直接影响着CAR-T产品最终的治疗应用。最终的CAR-T细胞产品需“个体化”来自于每个患者，但编码CAR的病毒载体可以大量地生产，并在-80℃长时间储存。 LV载体多采用三质粒或四质粒瞬时转染包装细胞（如293 T/17或293 T细胞）的方法进行制备，制备周期一般为2周。
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▲LV载体制备（图片来源：Methods in Molecular Biology） LV生产的上游工艺主要包括细胞培养（分为悬浮/贴壁培养等）和病毒包装；下游工艺一般涉及澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤。与细胞分离步骤一样，载体的无菌性至关重要，因为最终的CAR-T细胞产物无法通过过滤进行灭菌。
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▲Oxford BioMedica为诺华Kymriah代工的慢病毒制造流程（图片来源：Molecular Therapy）目前主要存在的挑战包括LV成本高、收率低、活性容易丧失等。 LV生产成本高也是CAR-T定价持高不下的一个主要原因，因此，高成本效益的LV生产对于满足商业需求并平稳过渡到临床生产规模至关重要。Gibco? LV-MAX?慢病毒系统是首套完整的悬浮液生产系统，与使用聚乙烯亚胺（PEI）的慢病毒生产方法相比，该系统产量可提高十倍之多，成本降低一半以上。 Gibco? LV-MAX?慢病毒生产系统能够达到>1 x 10^8 TU/mL（未浓缩）的高滴度，提供研究级及Gibco? CTS? LV-MAX?慢病毒生产系选择，后者既符合GMP医疗器械标准（21CFR第820部分），同时遵守美国药典USP <1043>**和欧洲药典Ph. Eur. 5.2.12建议。
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▲ Gibco? CTS? LV-MAX? 慢病毒生产系统 2.2 基因编辑目前已上市的 CAR-T细胞和大部分在研细胞免疫疗法仍然属于自体疗法。然而，自体疗法存在着成本高、等待时间长、T细胞质量参差不齐、治疗实体瘤效果不明显等局限性，这也使得同种异体（也称为“现货型”、“通用型”）CAR-T的开发显得尤为必要。基因编辑技术可以实现外源基因的靶向插入或内源基因的定向敲除，精确构建CAR-T细胞，已在同种异体CAR-T疗法的开发中被广泛使用。基因编辑应用于同种异体CAR-T ，可以限制移植物抗宿主病（GVHD）和免疫排斥反应的发生，同时也能够实现CAR-T细胞功能的增强。
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▲ 利用CRISPR/Cas9构建同种异体CAR-T（图片来源：Human Vaccines & Immunotherapeutics） CRISPR/Cas9是现在应用最广泛，研究最深入的基因编辑工具。与TALENs和ZFNs相比， CRISRP/Cas9的精确性更高，能降低脱靶效应带来的副作用，且更利于规模化生产。从生产过程来看，同种异体CAR-T与自体CAR-T大体上类似，不同点在于同种异体CAR-T的原材料来自健康供者而非患者；另外，采用基因编辑的同种异体CAR-T生产过程中，增加了引入基因编辑工具改造特定基因的一步。
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▲ 同种异体CAR-T的生产（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）基因编辑应用于T细胞改造的递送方法包括慢病毒、腺病毒、AAV等病毒载体递送；使用质粒或者核糖核蛋白RNP电转；使用编码Cas9的mRNA与sgRNA共电转等。然而，需要注意的是，优化这些方法的转导效率仍是基因编辑CAR-T需要改进的方向，也是降低同种异体CAR-T生产成本、扩大生产规模的重要因素。

一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理( 二 )

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