一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理( 三 )

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▲ 基因编辑技术在CAR-T改造中的应用（图片来源：Briefings in Functional Genomics） Gibco? TrueCut? Cas9蛋白（CTS?-Prototype）是一种用于临床前研究的Cas9蛋白新标准，现已上市销售，可作为工艺过程开发期间进行临床前研究和评价的早期测试材料。它专为临床前研究的严格要求而设计，并按照严格的指导原则进行生产，可确保质量和一致性，同时，其市场领先性能可与已在多家细胞治疗公司的临床项目中得到应用的Invitrogen? TrueCut? Cas9蛋白v2相媲美。
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▲ Gibco? TrueCut? Cas9蛋白（CTS?-Prototype） 2.3电穿孔电穿孔是最早和应用最广泛的非病毒转染策略之一。一个短的电脉冲作用于细胞，以产生暂时的通透性，并允许编码目的基因的DNA或RNA的注入。利用电穿孔进行mRNA转移的转导效率多在90%以上，且设计相对容易，性价比高。除此之外，利用mRNA电穿孔介导CAR基因表达，可能相比病毒转导更为安全。与通过病毒转导或质粒DNA转染引入转基因的稳定和永久表达不同， mRNA转移提供了一种胞质表达系统，可使T细胞实现CAR基因的瞬时表达。在此过程中，目前还没有证据表明mRNA会整合至人体基因组中，因此，插入诱变的可能性非常低，也不会产生具有复制能力的病毒（RCR/RCL）。Invitrogen? Neon? 电转染系统是新一代高效转染原代、干细胞和难转染细胞的电穿孔装置，具有灵活性、简易性和通用性等优势，让研究人员广泛受益。
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▲Invitrogen? Neon? 电转染系统03
细胞扩增和洗涤
通过基因修饰获得稳定的CAR-T细胞后，还需要进行大规模的体外扩增，才能获得达到治疗所需剂量，一般为十亿至百亿级别（根据患者体重和治疗周期决定）。扩增T细胞仍是CAR-T疗法的关键挑战之一，有许多患者最终无法接受该疗法，原因就在于这些患者的T细胞无法在体外充分扩增，未达到目标剂量。
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▲CAR-T细胞培养和洗涤（图片来源：Molecular Therapy）细胞可以通过不同的容器进行扩大，包括T瓶、平板或培养袋以及生物反应器。利用摇摆式生物反应器（例如WAVE）进行扩增，是目前主要的培养方式；除此之外，自动化的细胞生产设备（例如CliniMACSProdigy）也能够生产出大量的CAR-T ，这种自动化的设备比起摇摆式生物反应器能大大减少人为操作。
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▲CAR-T生产的多种途径（图片来源：UCL） CAR-T细胞的扩增环节还可以从培养基的使用上去优化。传统的人血清培养基价格昂贵、批间差异大、检测难，并且可能包含新出现的感染问题，以及可能对T细胞扩增和存活有害的物质。无血清培养基是一个很好的选择，用来源和化学成分非常清晰的原料，代替血清为宿主细胞提供营养，可以降低被外源物质污染的风险。成本方面，采用血清代替物培养的细胞，其繁殖能力和生长能力等参数能够达到与血清培养的细胞相当，但成本降低了很多。赛默飞的细胞培养基和试剂能够最大程度地减少污染和变异的风险，同时提供大量的可追溯性文档（包括FDA药物主文件和法规支持文件）用于监管审查，从而促进从研究到商业化的无缝过渡。此外，赛默飞设计了具有灵活性和适应性的生物工艺容器，以便满足适用于封闭式系统的培养基和试剂的需求。
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▲ Gibco? CTS? AIM V? 无血清培养基04
质量监控
目前，细胞治疗产品的质量控制分为四个大的方面，分别为安全性、纯度、效力以及均一性，这些质量控制会贯穿CAR-T生产的各个阶段。安全性除了常规的内毒素、支原体及无菌外，如果采用病毒载体进行转导，还需保证病毒的高质量，避免存在RCR/RCL、低风险的整合特征等风险。CAR-T的效价主要指T细胞的激活程度，由于T细胞的激活涉及一系列的细胞因子以及癌细胞的杀伤，因而真实效价往往难以获得。通常会选取有代表性的指标，如IFN-γ的表达，来评估T细胞的激活。CAR-T的均一性和纯度则要对不同的细胞表面标志物进行检测，包括CAR-T细胞中的非目标细胞成份和杂质并限定其比例，包括NK细胞等；以及用于鉴别CAR-T细胞中目标T细胞的比例，例如%CD3+T细胞等。

一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理( 三 )

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