知识科普|【维真生物-慢病毒包装】慢病毒包装原理及步骤( 三 )
②将慢病毒进行梯度稀释 ， 共做3个梯度 ， 即每孔（500μl 无双抗、无血清的DMEM培养基）中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病毒 ， 振荡混匀后加至接种好细胞的24孔板中 ， 加病毒之前将培养板中的培养基吸净 。
③感染 18-20h 后 ， 将培养板中的培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基 。
④感染 64-68h 后收集细胞并进行基因组DNA的提取 。
⑤测定时 ， 设置一组带荧光的已知TU的慢病毒作为对照 ， 以校验检测出的数值 。
2.1.2 提取基因组DNA（按照AxyGEN 的基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作）
2.1.3 qPCR检测
① 以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品 ， 慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数 。
② 以Actin质粒梯度稀释为标准品 ， Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数 。
③ qPCR
qPCR反应体系如下：
组成成分体积2 × SYBR Green mix10 μlPrimers (Forward & Reverse mixture)0.8 μl超纯水（DNase & RNase Free）7.2μl模板2μlTotal20μl
qPCR反应程序：
循环参数预变性95℃3min95℃5S60℃15S72℃15S+Plate Read39个循环
2.1.4 计算慢病毒IU（Integration Unit）ml-1
IU ml-1=(C×N×D×1000)/V
注：C=平均每基因组慢病毒整合拷贝数D=病毒的稀释倍数N=感染时细胞的数目（约为2.5×105）V=加入稀释病毒的体积数
2.2 孔稀释法标定带荧光的重组慢病毒滴度
Day1:细胞的准备
在96孔板中的每个孔中接种1-4×104个 HEK293细胞 。
Day2:病毒的稀释与感染
在Eppendorf管中做10倍梯度稀释 ， 分别是1~10-6梯度 。 弃去96孔板中原有的培养基 ， 将稀释好的病毒依次加入孔中 ， 注意是两个重复 ， 并做好标记 。
实验预览如图：
Day5:荧光计数与滴度计算
感染72h后 ， 用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数 。 数出最后两孔的荧光细胞数 ， 计算2个重复孔内的总数之和并计算出平均数 ， 假设为A（倒数第二孔的荧光细胞平均数）和B（倒数第一孔的荧光细胞平均数） 。
慢病毒滴度计算公式： 病毒滴度 (TU/ml) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μl）
3. 慢病毒的使用 3.1 重组慢病毒体外感染细胞
不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同 。 建议在正式实验前 ， 在目的细胞中进行预实验摸索最佳MOI值 。
3.1.1 慢病毒感染目的细胞预实验
为了节省病毒 ， 推荐使用96孔板进行预实验 。 操作步骤如下：
①第一天 细胞的准备
将目的细胞接种于96孔板中 ， 细胞融合率为50%为最佳 。 为保证细胞生长良好 ， 请保证细胞贴壁过夜 。
②第二天 病毒的稀释
取10μL慢病毒原液加入90μL培养液中做1:10稀释（10-1） ， 以此为起点做梯度稀释直至稀释10-7 。 可根据实际情况降低或提高稀释倍数 。
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