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Worthington过氧化物酶活性的6种测定方法

抗体 基因疗法


Worthington过氧化物酶活性的6种测定方法


过氧化物酶 (HRP)是一种血红蛋白 ， 可催化过氧化氢氧化多种底物 ， 例如抗坏血酸盐、亚铁氰化物、细胞色素c和许多染料的无色形式 。 HRP的分子量为40 kDa ， 最适pH值为7.0 。 稳定性：HPOFF在2-8°C下可稳定9-12个月 。 HPOD在2-8°C下可稳定2至3年 。
单位定义：一个 Worthington单位在25°C、pH 7.0下使用氨基安替比林和苯酚每分钟分解1μmole H 2 O 2 。
技术说明：RZ (Reinheitzahl)是吸光度比率 ， A 403 /A 275 ， 已被用作纯度的指示 。 然而 ， Shannon et al. JBC 241266 (1966)报道了同工酶的这个比率在2.50到4.19之间变化 。 这一点 ， 连同缓冲液和pH值的影响 ， 似乎使这个比率作为纯度标准的准确性受到质疑 。
许多不同的方法用于过氧化物酶活性的测定 。 下面列出了由艾美捷Worthington确定的一些近似转换 。
?1个Worthington单位= 4.6个Worthington以前使用的邻联苯胺单位
?1个Worthington单位= 0.62个ABTS单位（每分钟氧化的微摩尔染料 ， pH 6.0 ， 25°C ， 1.7 mM染料）
?1个Worthington单位= 2个ABST单位（μmole每分钟氧化的染料 ， pH 5.0 ， 25°C ， 8.7 mM染料）
?1 Worthington单位= 0.5愈创木酚单位（每分钟氧化愈创木酚的μmole ， pH 7.0 ， 25°C）
?1 Worthington单位= 0.5连苯三酚到purpogallin单位（mg产品每20秒 ， pH 6.0 ， 20°C）
?1 Worthington单位= 5连苯三酚到purpogallin单位（在pH 6.0 ， 30°C下每分钟微摩尔产品）
艾美捷Worthington过氧化物酶的测定：
方法：传统上 ， 过氧化物酶活性以连苯三酚的氧化速率为单位表示 ， 这是 Willstalter和Stoll在1917年引入的一种方法 ， 最近的研究表明这种方法有些不足 。 （Maehly和Chance 1954 。 ）在过氧化物酶测定系统中已经使用了多种氢供体 ， 包括可能致癌的化合物 ， 例如邻联茴香胺 。 采用4-氨基安替比林作为氢供体的改进测定法已被采用（Trinder 1966） 。 反应速率通过测量过氧化氢分解引起的510 nm处吸光度的增加来确定 。 在指定条件下 ， 在25°C和pH 7.0条件下 ， 一个单位会导致每分钟分解1微摩尔过氧化氢 。
试剂：
0.2 M磷酸钾缓冲液pH 7.0
0.0017 M过氧化氢 。 用试剂级水将1 ml 30%过氧化氢（Merck Superoxol或等效物）稀释至100 ml 。 用0.2 M磷酸钾缓冲液pH 7.0将1 ml该溶液进一步稀释至50 ml 。 每天准备新鲜 。
0.0025 M 4-氨基安替比林和0.17 M苯酚：通过将810 mg苯酚溶解在40 ml试剂级水中进行制备 。 加入25 mg 4-氨基安替比林并用试剂级水稀释至终体积为50 ml 。
酶：
以 1 mg/ml溶解在试剂级水中 。 临用前 ， 进一步稀释以获得0.02-0.04ΔA/min的速率 。
程序：
将分光光度计调整到 510 nm和25°C 。
将移液器移入每个比色皿 ， 如下所示：
苯酚/氨基安替比林溶液 1.4毫升
0.0017 M过氧化氢 1.5毫升
在分光光度计中于 25°C孵育3-4分钟以达到温度平衡并确定空白率（如果有） 。 加入0.1 ml稀释酶并记录A 510的增加4-5分钟 。 从曲线的线性部分计算ΔA 510 /分钟 。
计算：

注：虽然用苯酚安替比林法得到的反应速率比以前的方法低 4.5-4.7倍 ， 但过氧化物酶制剂是相同的 。
【Worthington过氧化物酶活性的6种测定方法】RZ (Reinheitzahl)是吸光度比 ， A 403 /A 275 (RZ)已被用作纯度的指示 。 然而 ， 香农等人 。 (1966)报告说 ， 同工酶的这个比率从2.50变化到4.19 。 这一点 ， 连同缓冲液和pH值的影响 ， 似乎使这个比率作为纯度标准的准确性受到质疑 。

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