学术期刊JBC | GAP10可能参与无定形碳酸钙（ACC）的沉积！( 三 ) _蛋白质

使用反义探针显示出强烈的特异性信号的转录物定位于胃石盘的柱状上皮，并且在相邻的肌肉组织中未检测到（图4B）。有义链探针未检测到信号。
*05
蜕皮激素与GAP 10 dsRNA 每天重复注射到蜕皮动物，导致蜕皮前持续时间（达到 MMI = 0.1 的天数，参见“实验程序”下）从注射蜕皮激素的对照组的平均 10.1 天增加蜕皮激素和GAP 10 dsRNA组至13.1天，两组差异有显着性（p <0.05）（图5）。
另一组注射蜕皮激素和CqVgdsRNA（一种主要在生殖雌性中发现的肝胰腺特异性基因）并用作序列特异性沉默的对照。

图5

FIGURE 5Prolongation of premolt following GAP 10 silencing. Mean premolt duration (the number of days until experiment termination) was calculated for each experimental group injected with ecdysone (n = 8; empty bars) or ecdysone and GAP 10 dsRNA (n = 10; black bars) or ecdysone and CqVg dsRNA (n = 6; gray bars). Asterisk represents statistically significant difference of p < 0.05.

该组平均蜕皮前持续时间为 8.2 天，显着低于蜕皮激素和GAP 10 dsRNA 注射组的计算值（p < 0.05）。
但与蜕皮激素注射对照组的计算值没有显着差异。
*06
还发现， GAP 10沉默导致胃石的发展具有明显的表面不规则性（图 6A），而不是在仅注射蜕皮激素的动物中形成的相当光滑的胃石。对于胃石表面粗糙度的分析，使用了OPIM分析（图6乙）。
对 OPIM 获得的地形图像的 SH 计算显示，蜕皮激素对照组 (4.4 ± 0.5 μm) 和蜕皮激素/ GAP 10 dsRNA 注射组 (11.3 ± 1 μm)之间存在显着差异 ( p < 0.001)（图 6 C ，对）。

图6

FIGURE 6Visualization and OPIM measurement of gastrolith surface irregularities and relative transcript levels of GAP 10 in the gastrolith disc following GAP 10 silencing. A top view of representative gastroliths dissected from crayfish injected with ecdysone (left) or ecdysone and GAP 10 dsRNA (right). B topographic images of representative surface samples from each group. C real time RT-PCR relative quantification of GAP 10 transcript levels in the gastrolith disc as calculated for each experimental group injected with ecdysone (n = 5; empty bars) or ecdysone and GAP 10 dsRNA (n = 6; black bars) and mean SH as calculated for the two groups (n = 3 and n = 4 respectively). Asterisk represents statistically significant difference of p < 0.01. Two asterisk represent statistically significant difference of p < 0.001.

蜕皮激素/ GAP 10 dsRNA 注射组中的GAP 10转录物水平显着低于蜕皮激素对照组（p < 0.01）（图 6 C ，左）。
\"
在这项研究中，从细胞外胃石基质中鉴定出一种由GAP 10编码的新型蛋白质。与 orchestin、GAMP 和 GAP 65 类似， GAP 10 具有酸性 pI 。
根据细胞外胃石基质中的蛋白质鉴定，推断的蛋白质序列包含预测的信号肽。不同于 GAP 65 (17) ，如 RT-PCR 和原位定位所示，GAP 10的蜕皮前转录物表达对胃石盘具有特异性。
此外，微阵列杂交显示， GAP 10的转录本在蜕皮前在胃石盘中显着上调，而在皮下组织中则显着下调，这表明它参与了胃石基质的构建过程。
GAP 10的表达模式由大多数胃石转录物共享，表明在蜕皮周期期间这两种上皮组织中结构和其他基因的表达调节的镜像模式。这种模式与这些组织已知的相反功能相吻合，特别是在钙化方面。
“
在蜕皮前，皮下组织从角质层吸收钙，而胃石盘将相同的钙沉积到胃石中。正如微阵列结果所证明的那样，GAP 10在换羽动物皮下组织中的表达表明该蛋白质在这个特定的换羽阶段发挥了作用。
研究 · 结论未发现 GAP 10 与 GenBank TM数据库中的任何已知蛋白质具有显着相似性。然而，它确实包含以前在节肢动物细胞外结构蛋白中发现的几个已知共有序列。
包括 AAP(A/V) 重复。该共有序列是一种小的疏水性四肽，主要存在于硬角质层的蛋白质中。 33) ，其中含水量低且硬化强烈。有人提出，该元素的重要性在于它在这些蛋白质的最佳折叠中的作用（34) ，因为 Pro 残基诱导肽链弯曲，疏水残基通过疏水相互作用稳定结构。
事实上，这种蛋白质，连同 orchestin 和 GAMP ，与 GAP 65 有很大不同，后者缺乏富含酸性氨基酸的序列并具有不同的特征结构域。从海绵Cathrina和海鞘Pyura pachydermatina的骨针中提取的蛋白质据报道可以稳定合成 ACC 长达 3 个月。
预计角质层蛋白中富含甘氨酸的区域具有形成β-转角的高趋势，其中转角将通过氢键稳定，并且疏水残基的侧链可以疏水相互作用。 AAP(A/V) 共识和富含甘氨酸的区域都被认为赋予基质蛋白弹性和高拉伸强度。