学术期刊JBC | GAP10可能参与无定形碳酸钙（ACC）的沉积！ _蛋白质

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研究·背景
胃石是甲壳类动物的钙储存器官，由几丁质-蛋白质-矿物质复合物组成，其中的矿物质成分是稳定的无定形碳酸钙。
【学术期刊JBC | GAP10可能参与无定形碳酸钙（ACC）的沉积！】迄今为止，仅在胃石中发现了三种蛋白质，即 GAP 65、胃石基质蛋白 (GAMP) 和 orchestin 。
在这里，我们报告了一种新的蛋白质 GAP 10 ，它从小龙虾Cherax quadricarinatus的胃石中分离出来，并在其胃石盘中特异性表达。
通过对从胃石基质中提取的蛋白质进行部分测序来克隆编码基因。基于组装的微阵列 cDNA 芯片， GAP 10发现转录物在蜕皮前的胃石盘中高度（12倍）上调，而在同一蜕皮阶段的皮下组织中则显着下调。
推断的 GAP 10 蛋白质序列缺少几丁质结合结构域，并且与 GenBank TM数据库中的已知蛋白质没有同源性。
研究 · 内容由于钙代谢在蜕皮期间外骨骼的周期性脱落及其随后的替换中的关键作用，甲壳类动物的生物矿化已经并将继续成为深入研究的主题。

几种甲壳类动物在蜕皮前阶段会形成临时的细胞外碳酸钙储存沉积物。在淡水小龙虾中，包括我们的模式生物红爪小龙虾Cherax quadricarinatus ，这些沉积物包括一对盘状结构，称为胃石，位于胃壁的每一侧。胃石也存在于其他十足类动物中，包括龙虾和几种陆蟹。
胃石形成发生在胃石袋中，胃石盘的柱状上皮和贲门胃壁之间形成一个空腔。胃石盘上皮的主要功能是将血淋巴钙转运至胃石和合成胃石有机基质。
与外骨骼一样，胃石由几丁质有机基质组成，其中沉积了碳酸钙。在大多数甲壳类动物中，外骨骼的碳酸钙以两种多晶型物之一的形式存在，一种是稳定的结晶方解石或不稳定的无定形碳酸钙 (ACC) 。
在C. quadricarinatus中，存在的主要钙形式是 ACC ，不仅在胃石中，而且在外骨骼中。否则不稳定的 ACC 的稳定可能需要独特的条件和细胞外基质内特殊大分子（如蛋白质或肽）的介导。
迄今为止，在甲壳类动物中仅鉴定出三种瞬时储存器官蛋白，如下所示：orchestin、胃石基质蛋白 (GAMP) 和 GAP 65 。

Orchestin 是一种钙结合磷蛋白，从陆生甲壳动物Orchestia cavimana。
GAMP ，从小龙虾Procambarus clarkia的胃石中分离出来，被认为是一种抑制碳酸钙沉淀的几丁质结合蛋白。
GAP 65 是从C. quadricarinatus的晚期蜕皮前胃石中提取的，是一种钙结合糖蛋白，预计会结合几丁质。 GAP 65的体内沉默导致形成形态畸形的胃石和稀疏排列的 ACC 小球，表明该蛋白质具有双重功能，即在细胞外基质的形成和胃石的钙化过程中。

所有三种蛋白质都具有酸性 pI 值，并且都在蜕皮前钙储存形成组织中表达，而 GAMP和 GAP 65 也在皮下组织中表达。对涉及钙化几丁质基质的蛋白质进行的这些和其他研究表明，磷酸化、钙结合、酸度和结合几丁质的能力等特征与其性能相关。
每天重复注射GAP 10双链 RNA 以预先蜕皮C. quadricarinatus导致蜕皮前阶段延长，并导致胃石的发展具有不规则的粗糙表面。
在这里，我们报告了从 premolt C. quadricarinatus的胃石基质中获得的一种新型蛋白质的鉴定和表征及其编码转录本。转录物的体内沉默导致蜕皮前阶段的延长和具有显着表面不规则性的含无定形矿物质的细胞外基质的发展。
研究 · 结果*01
从胃石中提取并用 100-200 mm NaCl 从 DEAE 柱洗脱的蛋白质部分显示出显着的条带，以~11 kDa 的表观分子量迁移（数据未显示）。
使用胰蛋白酶消化片段的串联 MS 成功对转录物进行测序，然后使用基于纳米喷雾 QTof2 的退化引物，然后使用用于 5'-和 3'-cDNA 末端快速扩增的特异性引物（图 1）。 1278-bp 转录本包括一个 53 bp 的 5'-非翻译区、一个 342 bp 的开放阅读框，编码推导出的 114 个氨基酸蛋白质序列，以及一个 880 bp 的 3'-非翻译区。