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ul|知识分享：原核蛋白的表达、分离和纯化

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ul|知识分享：原核蛋白的表达、分离和纯化
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实验原理：
携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中 ， 在37℃ ， IPTG诱导下 ， 超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白 ， 该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯 ， 实为金属熬合亲和层析（MCAC） 。 蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析 。
实验材料：
大肠杆菌BL21
试剂、试剂盒：
LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠
仪器、耗材：
摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒
实验步骤：
一、试剂准备
1. LB液体培养基：Trytone 10 g ， yeast extract 5 g ， NaCl 10 g ， 用蒸馏水配至1000 mL 。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL 。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4 ， 10 mM Tris ， 8M Urea ， 10 mM 2-ME ， pH8.0 。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4 ， 10 mM Tris ， 8 M Urea ， pH6.3 。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4 ， 10 mMTris ， 8M Urea ， 500 mM Imidazole ， pH8.0 。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤 ， -20℃保存 。
二、获得目的基因
1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板 ， 按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点） ， PCR循环获得所需基因片段 。
2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA ， 以mRNA为模板 ， 逆转录形成cDNA第一链 ， 以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物 。
三、构建重组表达载体
1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切 ， 酶切产物行琼脂糖电泳后 ， 用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段 。
2. PCR产物双酶切后回收 ， 在T4DNA连接酶作用下连接入载体 。
四、获得含重组表达质粒的表达菌种
1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α ， 根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选 ， 挑取单斑 ， 碱裂解法小量抽提质粒 ， 双酶切初步鉴定 。
2. 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确 ， 进入下步操作 。 否则应筛选更多克隆 ， 重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点 。
3. 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞 。
五、重组蛋白的诱导
1. 接种含有目的基因蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素） ， 37℃震荡培养过夜 。
2. 按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌 ， 一般转接1 mL过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中 ， 37℃震荡培养至OD600 = 0.6 -0.8（最好0.6 ， 大约需3 h） 。 取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析 。
3. 对照组不加诱导剂 ， 实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l ， 37℃继续培养1-3h 。
4. 12 000 rpm 离心10 min ， 弃上清 ， 菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中 。
六、重组蛋白的分离、纯化
1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1 mL NTA介质 ， 并分别用8 mL 去离子水 ， 8 mL上样缓冲液洗涤 。
2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀 ， 加入5 mL上样缓冲液 ， 用吸管抽吸重悬 ， 超声波破裂菌体 ， 用振荡器等轻柔的混匀样品60 min ， 4℃12000 rpm 离心30 min ， 将上清吸至一个干净的容器中 ， 并弃沉淀 。 取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析 。
3. 上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱 ， 收集流出液 ， 取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析 。
4. 洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱 ， 直至OD280 = 0.01分步收集洗脱液 ， 约3-4 h ， 取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析 。
5. 洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱 ， 收集每1 mL 级分 ， 分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析 。
注意事项
1. 选择表达载体时 ， 要根据所表达蛋白的最终应用考虑 。 如为方便纯化 ， 可选择融合表达；如为获得天然蛋白 ， 可选择非融合表达 。
2. 融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时 ， 对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰 。
3. 菌液OD值要小于1 ， 否则细胞太浓太老 ， 不易破碎 ， 且质粒易丢失 。
4. 诱导时间最好做一个梯度 ， 不同蛋白诱导时间需摸索 。
5. 诱导温度适当摸索 。
6. IPTG浓度：一般在1 mM 以内 ， 可适当摸索 。
【ul|知识分享：原核蛋白的表达、分离和纯化】7. 超声条件可视实际情况改变 ， 只要使菌体裂解充分即可 ， 即菌液清亮不粘稠 。
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