细胞质|知识分享：自噬研究_复合物|噬体|TomEgilHansen

一、自噬简介
1、大自噬（macroautophagy），也就是通常说的自噬（autophagy），是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分（细胞器、蛋白等）被双层膜的囊泡包裹，形成自噬体（autophagosome），进而传递到溶酶体进行降解的过程。
详细来说，自噬过程与内涵体途径（endolysosomal pathway）密不可分（见图1）。一方面，自噬体能够与晚期内体（late endosome）融合形成中间囊泡（amphisome）最终形成自噬溶酶体（autolysosome）；另一方面，自噬体能够直接与溶酶体（lysosome）融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径，自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。
细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下，可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响，从而防止某些疾病的发生（如神经退行性疾病和癌症）。饥饿等也可诱导自噬的发生，通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。

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图1 自噬过程及其与内涵体途径的关系
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen ， BMC Biology ， 2011)
2、自噬的调控
雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在自噬反应中起着重要的调节作用。 mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，自噬反应被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）未被抑制后，自噬反应机制被启动。作为酵母中Atg1的同系物，三个相关的丝氨酸/苏氨酸激酶 UNC-51样酶-1 ， -2 ， -3（ULK1, ULK2, UKL3），通过与mTOR复合物之间的相互作用来实现自噬反应。 ULK1、ULK2、mAtg13和骨架蛋白FIP200（酵母Atg17的同系物）一起形成一个复杂的复合物。 Class III PI3K复合物由hVps34, Beclin-1 (酵母 Atg6的同系物), p150 (酵母Vps15同系物), 和类Atg14蛋白 (Atg14L or Barkor) 或者紫外线放射抗性相关蛋白UVRAG (ultraviolet irradiation resistance-associated gene )蛋白组成，其在诱导自噬反应中起关键作用。 Atg基因通过形成Atg12-Atg5 and LC3-II (Atg8-II)复合物来调控自噬体的形成。在Atg7和Atg710（分别对应泛素活化酶E1和泛素结合酶E2酶）的作用下， Atg12和Atg5之间通过一个类泛素反应结合形成Atg12-Atg5 ， Atg12-Atg5再通过非共价键与Atg16结合形成多聚体Atg12-Atg5-Atg16 ，参与自噬体的扩张。在Atg4、 Atg7和Atg3的作用下， LC3转变为LC3-II-PE并紧密结合于自噬泡膜表面，参与前自噬体的延伸。
自噬既能抑制也能促进细胞凋亡，两种反应在生物体内广泛存在。在营养缺乏时，自噬反应作为一个细胞的促活反应机制存在，但是过量的自噬反应也会导致细胞死亡，但由自噬导致的细胞死亡与细胞凋亡在形态学上有明显的不同。几种促凋亡信号因子，如TNF, TRAIL, and FADD也会诱导自噬的反应发生。此外， Bcl-2也是自噬反应重要的调节因子，其为凋亡抑制蛋白，通过与Beclin-1结合形成复合物，来抑制由Beclin-1诱导的细胞自噬。
线粒体自噬属于选择性自噬，其主要作用是降解细胞中损伤以及不需要的线粒体。当线粒体损伤之后，在正常的线粒体中持续被降解的PINK蛋白（PARL促进此反应）会处于稳定状态，再通过E3连接酶Parkin的作用来诱导线粒体自噬。 Parkin会诱导线粒体膜蛋白的聚泛素化，由此导致与LC3结合的自噬受体蛋白的SQSTM1/p62, NBR1, and Ambra1聚集。此外，在特定的细胞类型中，同样存在LC3结合区域（LIR）的BNIP3 和 BNIP3L/NIX直接通过泛素依赖型反应机制也会聚集自噬反应的相关因子，进而促进自噬体的形成。

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3、LC3
LC3（light chain 3）简称于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3) ，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。
LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的LC3-I 。在自噬过程中， LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合，形成LC3-II并定位于自噬体膜上（见图3）。哺乳动物中的LC3可分为三种： LC3A、LC3B和LC3C 。其中， LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。
【细胞质|知识分享：自噬研究】

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图3 LC3在自噬体形成中的作用
(Varuna C. Banduseela et al ， Phyciological Genomics ， 2012)
4、自噬流检测方法
细胞经自噬诱导或抑制后，需对自噬流的水平进行观察和检测，常用的技术手段见表1：

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表1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总
（Mizushima et al, Cell, 2010）
其中，电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限；而由于自噬过程发生快速，通过IB/WB检测LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到实验进行时长的影响。
想要准确检测自噬流的变化，需要多种技术手段共同使用，才能达到理想的实验效果，产生具有说服性的实验结果。
自噬双标产品：mCherry-GFP-LC3B腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相关病毒（AAV）
mCherry-GFP-LC3B自噬双标系统的工作原理为：未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中，由于mCherry与GFP共同表达，细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭，而mCherry不受影响，进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多，绿色荧光越少，则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻（见图4和附图）。
维真现推出mCherry-GFP-LC3B腺病毒、慢病毒和腺相关病毒，满足您实验的不同需要。
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