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宿主|知识分享：细胞转染

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宿主|知识分享：细胞转染
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实验原理：
转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术 。 随着基因与蛋白功能研究的深入 ， 转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法 。
常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染（永久转染） 。 前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析 。 一般来说 ， 超螺旋质粒DNA转染效率较高 ， 在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果 ， 常常用到一些报告系统如荧光蛋白 ， β半乳糖苷酶等来帮助检测 。 后者也称稳定转染 ， 外源DNA既可以整合到宿主染色体中 ， 也可能作为一种游离体（episome）存在 。 尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高 ， 外源DNA整合到染色体中概率很小 ， 大约1/104转染细胞能整合 ， 通常需要通过一些选择性标记 ， 如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因）、潮霉素B磷酸转移酶（HPH）、胸苷激酶（TK）等反复筛选 ， 得到稳定转染的同源细胞系 。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径 。 电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多 ， 如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法 ， 有较为原始的原生质体转染 ， 和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术 。
理想细胞转染方法 ， 应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点 。 病毒介导的转染技术 ， 是目前转染效率最高的方法 ， 同时具有细胞毒性很低的优势 。 但是 ， 病毒转染方法的准备程序复杂 ， 常常对细胞类型有很强的选择性 ， 在一般实验室中很难普及 。 其它物理和化学介导的转染方法 ， 则各有其特点 。
需要指出的一点 ， 无论采用哪种转染技术 ， 要获得最优的转染结果 ， 可能都需要对转染条件进行优化 。 影响转染效率的因素很多 ， 从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态 ， 到转染方法的操作细节 ， 都需要考虑 。
常见的转染方法及比较
转染技术的选择对转染结果影响也很大 ， 许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例、细胞数量、培养及检测时间等 。 一些传统的转染技术 ， 如DEAE右旋糖苷法、磷酸钙法、电穿孔法,、脂质体法各有利弊,其主要主要原理及应用特点如下：
转染方法
原理
应用
特点
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附在细胞膜上 ，被细胞内吞
稳定转染 瞬时性转染
不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用
DEAE-右旋糖苷法
带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞
瞬时性转染
相对简便、结果可重复
但对细胞有一定的毒副作用
转染时需除血清
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入
稳定转染
瞬时性转染
所有细胞
适用性广但细胞致死率高
DNA和细胞用量大 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件
病毒介导法
通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中
稳定转染
瞬时转染
可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等
【宿主|知识分享：细胞转染】逆转录病毒
特定宿主细胞
但携带基因不能太大细胞需处分裂期 需考虑安全因素
腺病毒
通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中
瞬时转染 特定宿主细胞
可用于难转染的细胞 需考虑安全因素
阳离子脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞
稳定转染
瞬时转染
所有细胞 适用性广
转染效率高,重复性好,但转染时需除血清
转染效果随细胞类型变化大
Biolistic颗粒传递法
将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达
瞬时性转染
可用于：人的表皮细胞,纤维原细胞, 淋巴细胞 系以及原代细胞
显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核
稳定转染
瞬时转染
转染细胞数有限 多用于工程改造或 转基因、动物的胚胎细胞
除上述传统方法外 ， 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术 ， 以其适用宿主范围广、操作简便、对细胞毒性小、转染效率高受到研究者们的青睐.其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）的转染性能最佳 ， 但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性 ， 且其合成工艺复杂 。 聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子 ， 每相隔二个碳个原子 ， 即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子 ， 使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体 。 这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞 ， 其效果好于脂质聚酰胺 ， 经进一步的改性后 ， 其转染性能好于树枝状聚合物 ， 而且它的细胞毒性低 。 大量实验证明 ， PEI是非常有希望的基因治疗载体 。 目前在设计更复杂的基因载体时 ， PEI经常做为核心组成成分 。线型PEI（Line PEI ， LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI ， BPEI）要早一些 ， 过去的研究认为在不考虑具体条件 ， LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低 ， 有利于细胞定位 ， 因此与BPEI相比应该转染效率高一些 。 但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物 ， 从而提高转染效率 ， 但同时细胞毒性也增大 。 超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基 ， 在染实验中发现这种PEI的毒性低 ， 但转染效率却较高. 。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联 ， 合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物 。 聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性 ， 因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒 ,从而提高转染效率 ， 当所形成复合物进入细胞以后 ， 其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解 ， 使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI ， 这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性 ， 其可降解性对体内应用也具有重要的意义 。
实验材料：
15ml离心管、培养皿、滴管 、酒精灯、培养瓶、培养液、胎牛血清、转染试剂、质粒、PBS、75%酒精、0.25%胰酶、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、显微镜、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、废液缸等 。
实验步骤（以脂质体转染为例）：
脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1：1) 。 它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ， 是目前条件下最方面的转染方法之一 。 转染率高 ， 优于磷酸钙法 ， 比它高5-100倍 ， 能把DNA和RNA转染到各种细胞 。用LR进行转染时 ， 首先需要优化转染条件 ， 应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等 ， 对每批LR都要做 。 先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间 ， DNA可从1-5ug和孵育时间6h ， 开始 ， 按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线 ， 再选用LR和DNA两者最佳的剂量 ， 确定出转染时间 。 因LR对细胞有一定的毒性 ， 转染时间以不超过24h为宜 。
一、方法一的操作步骤1、取6孔培养板 ， 向每孔中加入2ml含(1-2) x 10 5 个细胞的培养基 ， 37℃、18% CO 2 培养基40%-60%汇合时 。
2、转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量) 。A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug ， 终量100ul 。B液：用不含血清培养基稀释LR ， 使终浓度为2-50ug ， 终量100ul 。轻轻混合A液、B液 ， 室温中置10-15min ， 稍后会出现微浊现象 ， 但并不妨碍转染 。3、转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次 ， 再加入1ml不含血清培养基 。4、转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中 ， 摇匀 ， 置37℃温箱中6-24h ， 吸除无血清转染液 ， 换入正常培养基继续培养 。5、其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同 。6、注意：转染时切勿加血清 ， 血清对转染效率有很大影响 。二、快速脂质体转染法操作步骤(方法二)： 1、 将细胞以5 x 105个/孔接种于6孔板中培养24h ， 使其达到50%-60%板底面积 。2、 在试管中配制DNA-脂质体复合物 。a. 在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA 。b. 旋转1s ， 再加入脂质体悬液 ， 旋转 。c. 室温下放置5-10min ， 使DNA结合在脂质体上 。3、 弃去细胞中的旧液 ， 用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去 ， 向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物 ， 37℃培养3-5天 。4、再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM ， 继续培养14-24h 。5、吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM ， 2ml/孔 ， 再培养24-48h 。6、用细胞刮或消化法收集细胞 ， 以备分析鉴定 。三、稳定的脂质体转染法：1、接种细胞同前述 ， 细胞长至50%板底面积可用于转染 。2、DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前 。3、在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM ， 37℃培养48h 。
4、吸出DMEM ， 用G418选择性培养基稀释细胞 ， 使细胞生长一定时间 ， 筛选转染克隆 ， 方法参照细胞克隆筛选法进行 。四、Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞 。 (别的方法可以参考生产商提供的protocol) 1、转染前1天将0.5～2×105细胞接种于24孔培养板 ， 并加入500ul不含 抗生素 的完全培养基 ， 以保证转染时细胞汇合达90～95％ 。2、准备复合物 a. 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀 。b. 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中 ， 轻轻浑匀 ， 室温孵育5分 。 注意：必须在25分内进行 。c. 5分后将它们混合 ， 并轻轻浑匀 ， 室温孵育20分 。3、吸去培养板的培养基 ， 用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次 。4、将复合物(总体积100ul)加入培养孔 ， 前后摇动培养板使其分布均匀 。5、将细胞放入 培养箱 孵育4～6h后 ， 可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用) 。6、24～48h后可以观察转入 基因表达 情况 。7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代 ， 1天后更换筛选培养基筛选 。8、优化：要保证细胞汇合率达90～95％(比较高)；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5 ， 一般细胞1：2～3 。

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