图1：HiFi-FM的基本原理 。 a)与倒置显微镜集成的DOE示意图 。 b)探测点和周围约束点的全宽半极大值(FWHM)分别为δ和5δ/3 。 c)正分辨率测试目标线宽为δ的宽视场图像、NoFi图像和HiFi图像流程图 。 Ground-truth (GT)是线宽为δ的正分辨率测试目标 。 d)黑线和红线分别为(c)处宽视场、NoFi、HiFi和GT图像在u方向和v方向上的对应线 。
探测点和约束点的FWHMs分别为δ和5δ/3 ， 对应的PSF如图1b所示 。 图2a的照明系统PSF与图2b的成像系统PSF卷积后 ， 图2c探测器上的观测图像被模糊化 。 由图2c可以看出 ， I(m n)受到约束点的强度和分布的影响 ， 从而影响重建图像的真实性 。
图2：HiFi-FM的PSF分析 。 a)照明系统的PSF 。 b)成像系统的PSF 。 c)照明系统PSF与成像系统PSF卷积的有效PSF 。 图像尺寸:12δ × 12δ ，δ = 0.183λ/NA 。
2.2标准样品保真度表征
为了表现HiFi-FM的性能 ， 我们采用了探测斑和约束斑的大小 ， FWHM为δ和5δ/3 ， 如图1b所示 。 以线宽为δ的正分辨率测试目标为样本 ， 通过逐点方式对探测点的性能进行评估 。 考虑到方便实际应用 ， 成像物镜的NAs与照明物镜的NAs相当 ， 因此可以使用倒置显微镜来构建HiFi-FM 。 探测点I(m n)的观测强度叠加如图1c原始数据采集部分所示 。 有趣的是 ， 我们发现δ的线宽是可以被解析的 ， 但是由于约束点的存在 ， 样品的透过率函数与地面真相有很大的偏差 ， 特别是对于有明亮背景的暗物体 ， 如图1cd的NoFi图像所示 。
值得注意的是 ， HiFi- fm的分辨率由探测点决定 ， 而改进的HiFi算法不影响重建图像的分辨率 。 图1c、d为分辨率测试靶宽场、NoFi、HiFi、GT随δ线宽的流程图及图 。 也就是说 ， 由于伴随约束点和散斑的卷积 ， NoFi图像与图1d中的GT图像有明显的不同 ， 通过改进的HiFi算法可以重构HiFi图像 。
图3显示了来自正分辨率测试目标样本的不同图像的对比 。 正分辨率测试目标的HiFi图像在保证分辨率的同时保证了保真度(图1c和图3a) 。 使用HiFi-FM ， 图像的保真度在很大程度上得到了提高 。 与NoFi-FM相比 ， HiFi-FM图像与ground-truth图像的对比度和结构相似指数测度(SSIM)分别从0.027提高到0.99 ， 从0.14提高到0.98(图3a) 。 对于明亮背景下的样本 ， 保真度的差异通常比黑暗背景下的样本更明显 。 如图3b所示 ， 即使采用不同的重建参数(α1、α2、α3) ， 计算得到的与地面真实图像的对比度仍保持在95%以上 。 这表明 ， 采用HiFi算法的超分辨率图像对重构参数不敏感 。 因此 ， 大多数情况下不需要常规调整 ， 这大大方便了HiFi-FM作为日常成像工具的应用 。
图3：正分辨率测试目标重建保真度的定量表征 。 a)通过widefield、NoFi、HiFi、gt得到图1c、d中的图像对比度对比 。 b)不同重建参数(α = 0.22、0.27、0.34)的HiFi图像对比度图
3超分辨率探测点的生成
为了获得更高的分辨率和实际效率 ， 首先采用探测点周围的8约束超分辨率点 ， 如图1b所示 ， 首次作为照明物镜傅里叶平面上的理想强度分布Iideal(uv) 。 与迭代傅里叶变换算法(IFTA)相比 ， 提出了更精确的初始相位和有效的傅里叶平面约束来设计相位分布 。 探测点和约束点的相位分布和数值模拟结果分别如图4a、b所示 。 图4a中带倾斜因子的实验载频是为了避免零阶光束的影响 。 与艾里点的FWHM相比 ， 探测点的FWHM理论上缩小到36% 。 将探测光斑的实测FWHM实验收窄到艾里光斑的38% ， 分辨率达到65.2 nm(≈入射波长的1/8) ， 实验效率达到3.76% ， 如图4cd所示 。 图4bc中探测点和约束点的分布与图1b中HiFi图像重建算法中使用的Pillu(i j)的理想点的分布不同 ， 需要根据图4c中的实验结果来确定 。
图4：数值模拟和实验结果表明 ， 该方法生成了HiFi-FM探测点 。 a)产生探测点和约束点的相位分布 。 (b)和(c)分别为探测点和约束点的数值模拟和实验结果 。 d)艾里斑的实验结果 。 物镜:100×/1.45 NA 。
4实验结果
4.1. 荧光微珠成像:分辨率高达λ/8
为了量化HiFi-FM的分辨率增强 ， 我们使用荧光珠测试了分辨率 。 与NA = 1.45的宽视场图像相比 ， HiFi-FM图像的分辨率有明显提高 ， 特别是在图5ab白框区域 。 在输入波长为488 nm的激光束下 ， 用518 nm的发射波长对微珠进行荧光标记 ， 微珠的平均FWHM为50 nm(样品制备 ， 见补充图S2 ， 辅助信息) 。 由于荧光珠的尺寸与218 nm的衍射极限相比可以忽略不计 ， 因此可以将单个珠的FWHM视为系统的分辨率 ， 如图5c所示 。 图5b图像中放大的白色框区表明 ， 两个相邻的荧光珠在HiFi-FM中可以清晰地分辨 ， 而在图5a所示的宽视场图像中 ， 它们是模糊的 ， 无法分辨 。 预计HiFi-FM的重建分辨率可达λ/8 。
推荐阅读
- 抗原检测颜色越深病毒量越高吗？是否还会“二次感染”？
- AbMole科研-用于MR分子和化学放射增敏的\卵黄壳\样纳米系统的快速合成
- 胜过孙悟空“火眼金睛”的仪器—显微镜
- 一加11还有流浪地球联名款？行星发动机版未发先火，期待值已拉满
- 地球文明循环证据被发现？俄渔民意外打捞出2.5亿年前的高科技物品，引发轰动
- 时间旅行可能吗？
- 学习院士王承书弘扬科学家精神ppt
- 微小的金属雪花展示了新的纳米级制造方法
- 狗狗绝育意外去世，主人：医生跪下给狗道歉！