图5：用分辨率高达λ/8的HiFi-FM成像荧光珠 。 a)荧光珠宽视场图像和放大的白色框区(右上) 。 b)荧光珠的HiFi-FM图像和放大的白色框区(右上) 。 c) (a)和(b)所选直线上荧光珠的强度分布 。 物镜:100×/1.45 NA 。 比例尺:1μm 。
4.2. HEK 293T微管成像:21μm × 21μm FOV 0.13λ分辨率
我们还选择了在形态和超微结构上研究人类胚胎肾293T (HEK 293T)的不同细胞 ， 作为λ/8分辨率的HiFi显微镜的实际应用 。 细胞内结构的分布可以看作是一个未知的复杂分布 ， 并且应该考虑由于光照模式中约束点和斑点的卷积效应而导致图像保真度下降的可能性 。 在荧光生物样品中 ， 地面真实图像是未知的 ， 因此我们不能使用对比度和SSIM作为图像保真度的衡量标准 。 幸运的是 ， HiFi算法已经被证明对重构参数不敏感 ， 可以用来生成HiFi图像 ， 如图3b所示 。 293T细胞的小管用Alexa 488标记 ， 其在518 nm波长处有最大的发射 。 图6a-c显示了宽视场、NoFi和HiFi获取的HEK 293T细胞图像的小管 。 NoFi和HiFi图像如图6b、c所示 ， 由于没有考虑光照约束斑和斑的影响 ， NoFi图像整体上比其他图像更强 。 分析了HiFi和NoFi的差异 ， lg[I(b)/I(c)
的强度如图6d所示 ， 其中I(b)和I(c)分别为图6b、c的强度 。 HEK 293T微管光栅扫描图像如图S2(补充图；辅助信息)所示 。 我们选取了立体区域和虚线区域 ， 用放大后的图像细节来表示HEK 293T的分辨率 。 使用相同的样品、物镜、激发波长和荧光滤镜 。 与宽视场图像相比 ， HiFi-FM中HEK 293T微管的分辨率明显提高 。 定量地说 ， 沿着虚线L1和L2所选的线 ， HiFi-FM和宽视场图像的强度分布如图6ef所示 。 可获得分辨率为69 nm(≈0.13λ)的微管 ， 视场为21μm × 21μm 。 视频1是将实验获取的图像作为观测强度的堆栈来重建HiFi-FM图像 。
图6：21μm × 21μm视场HEK 293T小管成像 。 a) HEK 293T小管广场图 ， 放大的白色实心和虚线框区 。 b) HEK 293T小管的NoFi图像和放大的白色实心和虚线盒状区域 。 c) HEK 293T小管的HiFi图像 ， 放大的白色实心和虚线盒状区域 。 d)强度由lg[I(b)/I(c)
表示 ， 其中I(b)和I(c)分别为(b)和(c)的强度 。 e) (a) - (c)所选直线上白色虚线L1上HEK 293T小管的强度分布图 。 f) (a) - (c)所选直线上白色虚线L2的HEK 293T管状管强度分布图 。 比例尺:2.5 μ m 。 参见视频1 。
5讨论与结论
实验证明 ， 在保证HiFi结果的情况下 ， HiFi- fm可以重构高达69 nm(≈0.13λ)分辨率的空间复杂样品 ， 衍射效率高达3.76% 。 本文首次利用约束超分辨率光斑的思想产生了分辨率约为入射波长1/8的锐利探测光斑 。 在先验知识的辅助下 ， 本文提出的重构算法实现了高保真图像的超分辨率 。
理论上 ， 任何波长的HiFi-FM都可以获得更高分辨率的光斑 。 然而 ， 提高超分辨率成像的效率和分辨率是超分辨率成像领域共同关注的问题 。 在衍射光学辅助的HiFi-FM中 ， 约束斑的探测点不是圆对称的 。 由于迭代过程中目标场是方形的 ， 我们不使用极坐标下的优化程序 ， 同时不受二元结构对最优解的限制 。 此外 ， 约束点阵方案精确地提高了探测点阵的分辨率和效率 。
为了优化DOE性能 ， 通常存在权衡 。 随着搜索条件的变化 ， 可以有各种其他可用的设计 。 探测点的衍射效率小于3.76%是可以接受的 ， 可以发现许多结果显示分辨率高于65.2 nm 。 在我们的计算和实验中 ， 我们选择了效率可接受的光斑大小 ， 以确保21μm × 21μm FOV下HEK 293T成像小管的动态响应质量 。 放宽最大强度的接受准则 ， 可实现较高的分辨率 。 不可避免的是 ， 未预料到的斑点仍然存在 ， 这将影响观测强度 。 在HiFi图像重建算法中 ， 需要增加Pillu(i j)的使用区域 ， 以减少散斑的影响 。 在未来 ， 样本周围的预设区域为图像重建提供了更多的先验知识 。 本文提出的HiFi-FM可以应用于更广泛的领域和场景 ， 特别是对活细胞动态超分辨率成像敏感的应用 。 高保真远场超分辨率显微镜已经准备好在各种荧光和无标签的各种样品中实现 。
图S1：高保真远场显微镜(HiFi-FM)的实验设置 。 实验装置由两个主要系统组成:照明系统(蓝光)和成像系统(绿光) 。 准直激光束通过分束器照射空间光调制器(SLM) 。 在SLM上上传的设计相通过显微镜物镜在放置在压电陶瓷台上的样品中衍射 。 通过管透镜和发射滤光片将扫描到的样品捕捉到sCMOS上 。 在衰减器;SF ， 空间滤波器;美联社孔径;P偏振器;BS ， 分束器;空间光调制器SLM;米镜子;L镜头;Obj、客观;EF ， 发射滤波器;TL ， 管透镜 。
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